[发明专利]柔红霉素C-14羟化酶突变体及其基因工程菌的生产方法

权利要求书

1.一种柔红霉素C-14羟化酶突变体，其特征在于，柔红霉素C-14羟化酶突变体的基因编码的C-14羟化酶序列中，第121位的谷氨酸突变为缬氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种柔红霉素C-14羟化酶突变体，其特征在于，柔红霉素C-14羟化酶突变体的DNA序列中第361-363bp的GAG突变为GTG。

3.根据权利要求1所述的一种柔红霉素C-14羟化酶突变体，其特征在于，柔红霉素C-14羟化酶突变体的重组表达质粒的基因编码的C-14羟化酶序列中，第121位的谷氨酸突变为缬氨酸。

4.一种柔红霉素C-14羟化酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是由柔红霉素C-14羟化酶突变体的重组表达质粒转化入宿主细胞而获得。

5.根据权利要求4所述的一种柔红霉素C-14羟化酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述柔红霉素C-14羟化酶突变体的基因工程菌的宿主细胞是大肠杆菌。

6.根据权利要求1所述的一种柔红霉素C-14羟化酶突变体，其特征在于，将所述柔红霉素C-14羟化酶突变体的DNA序列克隆入宿主细胞，并将该宿主细胞的发酵菌体用于阿霉素的生产。

7.根据权利要求1、2、3、4、5或6任一所述的一种柔红霉素C-14羟化酶突变体，其特征在于，所述柔红霉素C-14羟化酶突变体、其基因工程菌、其重组表达质粒及其编码基因均可以应用在阿霉素、表阿霉素生产中。

8.一种柔红霉素C-14羟化酶突变体基因工程菌的生产方法，包括以下步骤：

Q1：菌链霉菌C5的C-14羟化酶基因的基因克隆方法，包括以下分步骤：

Q11：PCR扩增：

Q111：设计一对引物：

5’-CTGGATCCATGGGCGGTGGGCGGTCC-3’和

5’-ATAAGCTTCACGGGGCCGGCTTCTCG-3’;

Q112：以链霉菌C5菌体为模板，设计PCR扩增引物，进行PCR扩增,PCR体系为：2μl PCR buffer，25mMol/L的MgCl₂1μl,2.5m Mol/L的dNTP1.5μl，取1μl上述Q111步骤中的两条引物，牙签挑取少量链霉菌C5菌体做为模板，2个单位的Taq酶，二甲基亚砜1μl，最后用无菌水补足至20μl；

Q113：在94℃环境中变性10min后，保持94℃环境中变性30s，然后在72℃环境中退火30s，保持72℃环境中延伸2min；

Q114：上述Q13步骤共进行30次循环，随后在72℃环境中充分延伸10min；

Q12：含doxA基因的大肠杆菌质粒构建：

Q121：，先在1%的琼脂糖凝胶中对Q1步骤PCR扩增结束后的物质进行使用电压为100伏的核苷酸电泳；

Q122：割胶后，用胶回收试剂盒回收1400bp左右的DNA片段，将所获得的DNA片段和载体pTrc99A用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切；

Q123：酶切产物再次进行电压为100伏的核苷酸电泳，回收相应大小分别为900bp、4100bp左右的基因片段和载体，最后将载体和片段按1:3的比例混合后，加入1个单位的T4连接酶，16℃连接10小时以上；

Q2：对doxA基因的随机突变

Q21：取引物对：

5’-AGCCTGAATCACTTCCGAATTCA-3’和

5’-TTCATTGGACCTAATACCGATCA-3’；

Q22：取易错PCR反应体系50μl，包含物质为：20ng的Q1步骤完成后的含doxA基因的大肠杆菌质粒，各30pmol的Q21步骤中的一对引物，7mMol/LMgCl₂，50mMol/L KCl，10mMol/L Tris-HCl，0.2mMol/L dGTP,0.2mMol/LdATP，1mMol/L dCTP，1mMol/L dTTP,0.05mMol/L MnC1₂，和5个酶活力单位的Taq酶；

Q23：设置PCR反应条件为：在94℃环境下变性10min后，再保持94℃变性30s，然后于72℃环境下退火30s，保持72℃环境中进行延伸2min；

Q24：将Q23步骤重复进行30次循环，然后在72℃环境下充分延伸10min；

Q25：使用1%的琼脂糖凝胶，进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒回收1400bp左右的DNA目的片段；

Q26：以Q25步骤中回收纯化后的DNA片段作为引物，Q1步骤完成后的含doxA基因的大肠杆菌质粒，作为模版，进行PCR扩增，具体如下：

Q261:取反应体系物质配比为：20ng的DNA模板，此模板为Q1步骤完成后的重组大肠杆菌质粒；引物10μl，引物为Q25步骤中回收纯化后的DNA片段；2.5mM dNTP8μl，和2个酶活力单位的KOD聚合酶；

Q262：设置PCR反应条件为：在95℃环境中变性8min后，在保持95℃环境中变性45s,然后在58℃环境中退火45s,随后在68℃环境中延伸5.5min；

Q263：Q262步骤共重复进行25次循环，最后在保持68℃环境中充分延伸10min；

Q264：最终的PCR产物用DpnⅠ酶于37℃环境中，消化1小时后，经65℃环境中10min处理使DpnⅠ酶失活，即得到超过6×103个克隆的突变体库；

Q3：突变体库的筛选：

Q31：突变体转化：通过电击方法将步骤Q2完成后构建得到的突变体转化到感受态细胞E.coli DH10B中；

Q32：将完成Q31步骤转化后的感受态细胞E.coli DH10B细胞涂布于含氨苄抗生素的LB平板上，于37℃环境中进行培养；所述LB平板上另外还含有蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠1%、琼脂2%；

Q33：突变体筛选与鉴定：

Q331：挑取LB平板上长出的菌体转接于液体LB试管中，于37℃培养环境中，置于220转/分钟的摇床中过夜培养，第二天转接于装量50ml LB培养基的250ml摇瓶中，3小时后对菌体进行1mMIPTG诱导，继续培养18h后，4000转/分钟的速率离心15分钟后，收集菌体；

Q332：对收集的菌体进行柔红霉素的转化：2ml的0.1M磷酸缓冲液中溶解0.2g柔红霉素，加入等量的上述菌体，37℃水浴中、以200转/分钟的速率进行震荡，持续30分钟之后，测定盐酸表阿霉素的增加量；

Q34：从完成上述所有步骤的突变体基因工程菌库中，筛选获得酶活力得到提高的突变体基因工程菌。