[发明专利]一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法。

背景技术

肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的多步骤多因素过程，包括肿瘤细胞分泌酶解周围基质，从原发灶解离，进入血液循环，在血流中存活并穿出血管壁，继而形成转移灶的一系列过程。肿瘤细胞在血液循环中不可避免地与血液中的成分相互作用，而血液中的免疫细胞可清除肿瘤细胞，但血小板则能促进肿瘤细胞的转移。有研究发现，肿瘤患者常伴有血小板升高，抗血小板治疗可抑制肿瘤转移。

肿瘤细胞与血小板的相互作用在肿瘤转移过程中的作用主要体现在以下几方面：1、血小板粘附于肿瘤细胞表面，遮挡由血流剪切力引起的机械损伤，并帮助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的攻击，从而促进肿瘤细胞在血流中存活；2、粘附于肿瘤细胞表面的血小板，可同时粘附血管内皮细胞并导致血管内皮细胞收缩，从而促进肿瘤细胞在远隔部位的血管中停留下来，并穿出血管到达转移部位；3、血小板可释放血小板衍生生长因子、血管内皮细胞生长因子等细胞因子，可刺激肿瘤细胞的生长，以及肿瘤血供的形成。

因此，检测抗肿瘤药物对肿瘤细胞与血小板的粘附能力的影响程度对于评价其是否具有抑制肿瘤细胞转移和侵袭能力至关重要。目前常用的方法主要是，将肿瘤细胞种于细胞培养板中，待细胞完全贴壁，并完全融合后用待检测的抗肿瘤药物处理，将荧光或同位素标记过的血小板加入培养板中，孵育一定时间后，漂洗去除未粘附于肿瘤细胞的血小板，加入裂解液裂解细胞和血小板后，检测培养板中的荧光或同位素水平相对于未经抗肿瘤药物处理的荧光或同位素水平是否有所降低，反映待检测药物是否具有抑制肿瘤细胞与血小板粘附的活性，从而评价其在抑制肿瘤细胞侵袭和转移中的作用。

但目这种检测技术存在一定的局限性，主要体现在以下几方面：⑴无法模拟肿瘤细胞与血小板粘附的真实过程，肿瘤细胞处于贴壁状态，而在体内的血流环境中，肿瘤细胞处于悬浮状态，因此该方法不能反应真实的肿瘤细胞与血小板粘附过程；⑵实验操作复杂，需预先将细胞种于培养板，并使细胞生长至完全融合，实验周期较长；⑶难以定量检测，某些抗肿瘤药物能够杀死肿瘤细胞或使肿瘤细胞无法贴壁，如此造成药物处理组和对照组的肿瘤细胞数目不一致，无法真实反映是否是由于抑制肿瘤细胞和血小板粘附而达到的效果；⑷采用放射性同位素进行检查，造成辐射伤害和环境污染。因此需要开发一种准确、简便、安全，并能模拟真实体内粘附过程的实验技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法，使所述方法更加安全、准确、简便。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将荧光标记探针与富血小板血浆孵育，然后离心并吸取底层的血小板沉淀用血小板洗涤液洗涤，然后用血小板悬浮液重悬洗涤后的血小板，接着向血小板重悬液中加入CaCl₂，然后调整血小板浓度为10-100×10⁶个/mL以及CaCl₂浓度为1mM备用；

步骤2、将未经待检测抗肿瘤药物处理的肿瘤细胞设为对照组，经待检测的抗肿瘤药物处理后的肿瘤细胞为药物处理组，两组细胞分别经胰酶消化处理后用PBS洗涤，然后用肿瘤细胞悬浮液重悬得到对照组肿瘤细胞重悬液和药物处理组肿瘤细胞重悬液，调整两组肿瘤细胞密度为5×10⁶个/mL备用；

步骤3、将步骤2得到的两组肿瘤细胞重悬液分别和步骤1得到的血小板重悬液孵育，用多聚甲醛固定后于流式细胞仪上采用FL1通道检测肿瘤细胞荧光率获得药物处理组荧光率以及对照组荧光率；

将试验组荧光率和对照组荧光率进行统计学显著性差异分析得到检测结果。

其中，步骤1所述血小板浓度优选为30×10⁶个/mL。

本发明所述将试验组荧光率和对照组荧光率进行统计学显著性差异分析得到最终结果，是指两者进行显著性差异分析，如果药物处理组的荧光率降低且相对于对照组荧光率具有显著性差异则说明待测抗肿瘤药物具有抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性，能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

本发明所述肿瘤细胞在未经待测抗肿瘤药物处理前和对照组肿瘤细胞一样按照正常的培养方法培养，所述处理是向肿瘤细胞培养液中加入药物，这属于本领域公知处理方式。

本发明步骤1所述富血小板血浆（PRP）可按照常规方法从血液中提取，在本发明实施例中按照如下方法提取：