[发明专利]云南红梨PyMYB基因及其原核表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨色素和毛状体发生发育调控蛋白基因PyMYB及其原核表达载体，和原核表达载体和PyMYB抗体的应用。

背景技术

红色表皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨1号四个栽培品种。但生产中除云红梨1号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究表明，在拟南芥中，MYB转录因子PAP1/MYB75通过调控拟南芥花青素生物合成途径中的关键酶调控花青素的合成；拟南芥tt（TRANSPARENT TESTA）突变体中，类黄酮生物合成途径的许多步骤都是由MYB-bHLH复合物调控的，该复合物主要催化黄酮醇合成级联反应中的查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、二氢黄酮醇还原酶（F3H）和黄酮醇合酶（FLS）基因都是在光应答下协同表达的；油菜中过表达拟南芥MYB转录因子PAP1，导致叶片中酚类化合物大幅度的上升；Espley等人将苹果中MdMYB10转录因子在苹果中过表达，获得了红色的转基因苹果；Feng等将“奥冠”梨中的PyMYB10在拟南芥中过表达，结果增强了拟南芥成熟种子中花青素的含量。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTG1(WD40)和MYB蛋白（GL1, PAP1、PAP2、CPC、TRY）组合，形成MYB/bHLH/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTG1(WDR) 能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等人通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Zhao等人通过离子轰击试验证明了TTG1，bHLH转录因子GL3，MYB转录因子GL1和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB， CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTG1复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。Gonzalez等人发现MYB5和TT2（MYB）与TTG1能够形成复合物控制外种皮的分化。

目前，对云南红梨着色机理研究表明，云南红梨果皮花青素的生物合成可能是由MYB/bHLH/WD40调控的。但是还没有专门用于准确检测PyMYB蛋白的亚细胞定位、高效的进行PyMYB蛋白的纯化、高效分离PyMYB蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况及研究蛋白互作的抗体。本发明选择着色最好且稳定的‘云红梨1号’作为试验材料，开展云南红梨‘云红梨1号’PyMYB转录因子基因的克隆、序列分析和原核表达、蛋白纯化抗体制备的工作，将弥补这方面的空白，也将为研究云南红梨果皮MYB转录因子在果皮着色机理及果实育种中提供工具。

云南红梨属于稀有资源，世界市场缺口较大；此外，云南红梨外观和内在品质好，商品价值高，深受广大消费者青睐。因此，红梨将成为梨产业发展的主要方向，红梨育种成为梨树育种的重要目标。但是，指导育种的红梨着色的科学理论匮乏，本发明的成果将为果树及花卉的分子育种奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种云南红梨PyMYB基因，该基因来源于云南红梨，该基因是云南红梨花青素和毛状体发生发育调控因子，基因在R2结构域中具有所有花青素调控蛋白中的R残基，其R3结构域中具有碱性螺旋环螺旋（bHLH）结合结构域，其C末端也具有Motif 6。

本发明另一目的是提供云南红梨PyMYB基因的原核表达载体pGEX-4T-PyMYB，该载体含有PyMYB基因，上游有Ptac启动子和细菌核糖体结合位点RBS，Ptac启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，PyMYB基因的N端含有GST标签。

本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨色素合成特异性调控蛋白PyMYB中，PyMYB蛋白其具有典型的R2R3MYB结构域。