[发明专利]云南红梨PybHLH基因及其原核表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨花青素生物合成、毛状体发生发育及盐胁迫调控蛋白基因PybHLH及其原核表达和原核表达载体在制备PybHLH蛋白和特异性抗体中的应用。

背景技术

红色果皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨1号四个栽培品种。但生产中除云红梨1号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究较多，而对植物中的bHLH和WD40蛋白研究较少。在拟南芥中LDOX基因启动子直接包括EGL3和TT8在内的不同的MYB-BHLH-TTG1转录复合物的调控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突变体试验也表明了egl3和tt8是拟南芥幼苗花青素累积的必要条件。在拟南芥中JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白与WD-repeat/bHLH/MYB 转录复合物中的bHLH（Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer of Glabra3 [EGL3]）和R2R3 MYB 转录因子(MYB75和Glabra1)互作，抑制了JA调控的花青素的累积和毛状体的发生，而JA诱导的JAZ蛋白的降解能够解除这种抑制。在大丽花(Dahlia variabilis)中，bHLH转录因子DvIVS通过调控DvCHS1, DvF3H, DvDFR和DvANS的转录来参与其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH转录因子MYCA1可能通过调控ANR和UFGT基因的表达来调控其花青素的生物合成。在龙胆花（G. triflora）中，GtMYB3和GtbHLH参与花青素的生物合成。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTG1(WD40)和MYB蛋白（GL1, PAP1、PAP2、CPC、TRY）组合，形成MYB/bHLH/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTG1(WDR) 能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、误表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获-耗尽机制：在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中， GL3通过结合毛状体形成蛋白TTG1来耗尽临近细胞中的TTG1，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因TTG1的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了TTG1，GL3，GL1和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTG1复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。另外，植物中的bHLH转录因子也参与植物抗逆性机制，拟南芥中过表达OrbHLH2或OrbHLH001基因增强拟南芥的抗盐和抗冷的特性。

在云南红梨着色机理研究方面，本实验室研究了光照对云南红梨着色的影响、构建了光诱导果皮差异表达基因的SSH文库，进行了着色相关基因的分离和表达分析。前期研究结果表明云南红梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40调控的。前期分离克隆的PybHLH基因的部分片段（△PybHLH）构建的原核表达载体，由于该载体只含有PybHLH基因的一段序列而不是全长序列，获得的PybHHL抗体特异性不是很理想，不能准确的用于分离与PybHLH蛋白相互作用的蛋白质和DNA片段；在前人研究基础上，针对云南红梨栽培品种早白蜜、满天红、美人酥着色不稳定、在国内外尚未见有关云南红梨果皮红色着色机理方面研究报道，本研究选择着色最好且稳定的‘云红梨1号’作为实验材料，克隆了‘云红梨1号’中PybHLH基因的全长序列，并且进行了序列分析、原核表达和蛋白纯化抗体制备的研究，这将为研究云南红梨转录因子PybHLH的结构和功能奠定了基础，并为作物花卉育种提供有利的科学依据。

发明内容