[发明专利]一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的固定化方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

瑞士乳杆菌属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，主要用于干酪的制造。近年来研究发现瑞士乳杆菌有较强的乳蛋白水解活性，其菌株制作的发酵乳具有较强的降血压功能，主要是因为瑞士乳杆菌蛋白酶能水解蛋白产生多肽，即血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽。ACE抑制肽作为一类具有抑制ACE活性的肽类物质，通过抑制ACE的活性，阻碍有升高血压作用的血管紧张素Ⅱ的生成，同时抑制具有降血压作用的血管舒缓激肽的分解，从而使高血压下降，达到降血压的功能。

目前用于治疗高血压的血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂（如卡托普利、阿拉普利等），都是一些化学合成物，因吸收排泄速度快，会引起咳嗽，肾脏损伤及血管神经性水肿等副作用；而来源于乳蛋白的ACE抑制肽，其降压效果虽不及合成药物强烈，但无此副作用，安全可靠。

目前，关于利用瑞士乳杆菌蛋白酶直接水解乳蛋白制备ACE抑制肽有一些报导，但是利用游离的瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳蛋白存在一定的弊端：（1）酶不能重复利用；（2）难以将产物和酶分离，从而需要进一步纯化；（3）游离酶不易保存，易失活而增加成本等。这一系列弊端使ACE抑制肽的大规模生产存在成本高而不稳定的问题。

本发明提供一种利用海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法。海藻酸钠是由α-L-古洛糖醛酸钠(α-L-guluronate，简称G)和β-D-甘露糖醛酸钠(β-D-mannuronate，简称M)1、4连接的长链线性多糖，海藻酸盐分子链G块容易与Ca²⁺作用，2条分子链G块间形成一个洞，结合Ca²⁺外形成蛋盒模型，形成热不可逆凝胶，具有较好的生物相容性和生物可降解性，从而将瑞士乳杆菌蛋白酶固定化在凝胶网络中。利用海藻酸钠包埋与戊二醛交联的双重固定作用，可实现瑞士乳杆菌蛋白酶的重复利用，并为其它酶制剂的固定化提供研究基础；将固定化瑞士乳杆菌蛋白酶作为制备ACE抑制肽的载体，可实现ACE抑制肽的连续化生产。

发明内容

本发明的目的：本发明的目的是提供一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法，得到的固定化瑞士乳杆菌蛋白酶可重复利用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法是，瑞士乳杆菌经过液体培养后得到发酵液，发酵液离心分离得到菌体，将菌体悬浮于Tris-HCl缓冲液中进行超声波破碎，破碎液离心后取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶酶液。在蛋白含量为4mg/mL～12mg/mL的瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入海藻酸钠，海藻酸钠的终质量浓度为1.5%～2.0%,混匀后用注射器滴入氯化钙溶液中，固化洗涤后加入戊二醛溶液交联，再洗涤沥干，即得到固定化蛋白酶。

上述方法中固定化步骤如下：在瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入海藻酸钠，37℃水浴搅拌混匀；用注射器吸取混合液，滴入0.1mol/L的氯化钙溶液中，立即成球；4℃条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.2%～0.8%的戊二醛溶液交联6h；洗涤沥干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。

本发明提供的海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法包括下列步骤：

（1）瑞士乳杆菌菌体的制备:将-80℃冷藏的瑞士乳杆菌冻干粉接种于MRS液体培养基（蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐温-801g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，水合硫酸镁0.5g，水合硫酸锰0.05g，蒸馏水1L，121℃高温灭菌20min），连续活化3代，在37℃下扩大培养至生长对数期取出。4℃，4500r/min，离心20min，收集菌体。用pH7.1Tris-HCl缓冲液(50mmol/L)洗涤菌体，混匀后在4℃，4500r/min，离心20min，收集菌体，菌体重复洗涤3次，冷藏备用。

（2）瑞士乳杆菌蛋白酶的制备：用pH7.8Tris-HCl缓冲液悬浮瑞士乳杆菌菌体，搅匀后进行超声波破碎，破碎条件为破碎功率300W，破碎时间3s，间隔时间5s，共破碎200次。离心（4℃，4500r/min，20min）后取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液，-80℃冷冻保藏备用。