[发明专利]猪丹毒杆菌抗原快速检测试纸条

说明书

 一、技术领域

本发明是一种涉及猪丹毒杆菌抗原的检测试剂显示器具，特别是涉及一种可检测猪丹毒杆菌抗原的检测试纸条。

二、技术背景

猪丹毒是由猪丹毒杆菌引起猪的一种急性、热性传染病。不同年龄的猪均可感染，但主要侵害3～12月龄的架子猪，哺乳仔猪和产子母猪很少发生。人感染发病时称为类丹毒。本病虽然一年四季均可发生，但在北方地区以夏季炎热、多雨季节流行最盛，而在南方地区则在冬春季节流行。常为散发性或地方流行传染，有时爆发流行。主要由污染的饲料、土壤经消化道感染，创伤皮肤也可感染。该病流行于世界各地，对养猪业危害很大。病猪、带菌猪、及带菌禽类是该病的主要传染源，潜伏期3~5天，其发病特征为急性病例呈败血型，开始发病时1~2头猪无任何症状突然死亡，随后出现较多的发病或死亡病猪，体温升高42℃以上。食欲废绝，行走摇摆，呼吸困难，粘膜发绀，发病几天后，胸、腹、四肢内侧及耳部皮肤出现大小不等的红斑，指压退色，病末期心脏衰弱、体温下降、虚脱死亡。剖检皮肤充血呈弥漫性红色。脾脏充血、肿大、柔软，呈暗红褐色。肾脏黄褐色或暗红色，充血肿大。肝淤血、棕红色。胃粘膜、十二指肠、空肠粘膜肿胀，大肠无明显变化。亚急性病例，在皮肤上发生大小不等、形状不一的紫红色疹块，俗称打火印。剖检病死猪除有特征性的皮肤疹块外，其脾、肾也表现败血型变化。慢性大多由急性、亚急性转变而来，主要表现关节炎和心内膜炎，剖检关节肿大、关节腔内淡黄色液体增多，关节囊增厚，关节变形。心内膜炎型常见于二尖瓣形成颗粒状增生物，外观似菜花样病变。常用检测方法如下。

（1）显微镜检查：将病料最好是肝、肾涂片（心内膜疣状赘生物可表面触片），自然干燥，用甲醇固定2～5分后，用美蓝或复红也可用姬姆萨氏或瑞特氏染色法及革兰氏染色法染色后镜检。本菌在镜下呈瘦长、正直或稍弯曲、纤细的杆菌。并呈散在、单个、成对或小堆状或簇集于白细胞中。从心内膜赘生物制成的涂片，常可见有弯曲、长短不等、丝状菌体，并呈乱发状。本菌为革兰氏阳性小杆菌；不产生芽胞；无鞭毛，不能运动。

    （2）细菌培养：①直接分离培养 对未被污染的新鲜病料可直接接种于血液琼脂或血清琼脂培养基，置37℃培养24～48小时后，观察结果。在血清琼脂上长出针尖大、透明、灰白色、圆形、微隆起的露珠状小菌落。在血液琼脂培养基上生长的菌落，周围有绿色的狭窄溶血环。如被检材料已经腐败或被污染，可在上述培养基中加入抗生素（100微克／毫升新霉素或400微克／毫升卡那霉素或加入叠氮钠和结晶紫各0.01％）抑制其它革兰氏阴性菌生长。②增菌培养 如病料中病原菌少时，应先作增菌培养，即取病料一铂耳，放入普通肉汤或血清肉汤（后者较好）中，培养24小时后观察结果。

    猪丹毒在肉场中培养24小时后，肉汤呈均匀一致的轻微混浊，管底有少量沉淀，振荡时沉淀物呈小絮片状浮起，无菌膜及附着于管壁的环状物；老龄培养时，多呈絮块或絮条样生长，并常悬浮于试管中央或沉于管底。

（3）动物试验：当病料中含菌量极少，或已被污染，作细菌分离诊断有困难时，可接种小动物作为辅助诊断，动物试验也是分离鉴定本菌的一个方面。其方法如下：将病料（疹块部渗出液或血液、脾、肝、肾等）或纯培养物接种于鸽子、小白鼠和豚鼠。先将病料磨碎，用灭菌生理盐水作5～10倍稀释制成悬液。鸽于胸肌接种0.5～l毫升，小白鼠皮下接种0.2毫升，豚鼠皮下或腹腔接种0.5～1毫升。若为肉汤培养物可直接接种。固体培养基上的菌落，需先用灭菌生理盐水洗下，制成菌液再接种。接种后1～4日，鸽子翅、腿麻痹，精神萎顿，头缩羽乱，不吃而死亡。小白鼠出现精神萎顿、背拱、毛乱、闭眼、不吃，3～7天死亡。死亡的鸽子和小白鼠可见脾脏肿大，肺和肝充血，肝有时可见小点坏死。取心血、肾、脾等，涂片镜检或分离培养，均可见有多量猪丹毒杆菌。豚鼠对猪丹毒杆菌有很强的抵抗力，接种后常不表现任何症状，仍健康存活。

（4）聚合酶链式反应(PCR)技术：PCR技术具有高灵敏度、高特异性等优点，PCR方法已被广泛运用于猪丹毒杆菌的鉴定和流行病学调查。此外，还建立了检测猪丹毒杆菌的ELISA方法。

上述检测方法需要专业人员在实验室操作，操作繁琐，检测费时费力；而且需要昂贵的仪器设备，如PCR仪、酶标仪等，对非专业人员而言，上述检测方法很难完成。虽然上述方法特异敏感，但无法实现现场快速检测或诊断。本发明，研究一种简便快速、实时在线检测试纸，对控制和消灭此疾病意义重大。

三、发明内容