[发明专利]大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体及其构建方法

权利要求书

1.一种由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体，其特征在于，其含有多克隆位点MCS，Am抗性基因，整合酶基因int，整合位点attp，接合转移片段oriT，BAC载体的复制区oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位点和loxP位点。

2.根据权利要求1所述的由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体，其特征在于，所述的BAC载体为pBTIBAC11，其核苷酸序列如序列表中序列13所示。

3.权利要求1所述的由大肠杆菌接合转移至链霉菌的BAC载体的构建方法，包括以下步骤：

（1）首先设计一对引物，5’端带有待替换氯霉素抗性基因上下游各55bp的同源臂，通过PCR扩增出含接合转移oriT、定点整合attp-int和抗性筛选Am的oriT-attp-int-Am的DNA片段，称之为替换盒；

（2）将Red同源重组辅助质粒pKD46电转至含待替换质粒pBeloBAC11的大肠杆菌k-12内，得到Ecoli k-12/pBeloBAC11/pKD46；

（3）30℃培养E.coli k-12/pBeloBAC11/pKD46过夜，次日按1:100转接，加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖，30℃培养至OD₆₀₀=0.4～0.6，制成电转感受态，将上述替换盒电转至其中，通过安普抗性筛选得到氯霉素抗性基因被替换了的替换子，命名为pBTIBAC1；

（4）体外合成链霉菌组成型启动子ermEP₁P₂，并与绿色荧光蛋白基因GFP连接，由EcoRⅠ和BamHⅠ酶切连入pBTIBAC1，得到重组质粒pBTIBAC1-eGFP，将该重组质粒转化ET12567/pUZ8002，再通过接合转移转至变铅青链霉菌中；

（5）合成新的多克隆位点MCS，其上包含EcoRⅠ、AvrⅡ、PacⅠ、PmeⅠ、SwaⅠ、BamHⅠ酶切位点，通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切插入到pBTIBAC1的相应位点，得到最终载体pBTIBAC11。