[发明专利]通过糖多孢红霉菌SACE_7301基因途径提高红霉素产量

说明书

技术领域

本发明主要涉及一种提高发酵生产红霉素产量的方法，尤其涉及一种通过增加糖多孢红霉菌染色体上正向调控基因SACE_7301提高红霉素产量的方法。

背景技术

放线菌次级代谢产物具有广泛的用途，如抗生素、抗癌剂、免疫调节剂、驱虫剂、昆虫防治剂。目前发现的23000种生物活性次级代谢产物中，有10000多种是放线菌产生的。然而，这些次级代谢物原始产量非常低，需要通过筛选才能获得工业生产高产菌株。过去工业生产菌株主要通过随机物理或化学诱变方法获得。传统的随机诱变技术不但耗时，而且无法指导对育种进行理性设计。本发明目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得红霉素高产菌株，用于红霉素或中间产物生产。

糖多孢红霉菌是1952年从土壤中分离出的革兰氏阳性丝状放线菌，其次级代谢产物红霉素A是重要的广谱大环内酯类抗生素，目前红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)被广泛用来治疗感染性疾病。由于红霉素及其衍生物每年的世界销售量达数百亿美元，吸引了许多科学家来研究如何提高其产量。2007年，Oliynyk等报道了糖多孢红霉菌NRRL23338的基因组序列，但糖多孢红霉菌调控基因研究很少，到目前为止只有bldD(SACE_2077)和SACE_7040的调控基因研究报道，及我们申报的发明专利（申请号 201210099708.8）。

原核生物的转录调控子可以分为LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC (EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR 和Crp等16个家族，其中TetR家族成员在DNA结合域方面具有螺旋-转角-螺旋（HTH）的结构特征。TetR家族在细菌中普遍存在，大约有2000多个成员，但到目前为止人们只发现100多个成员的特征。糖多孢红霉菌染色体上有101个TetR家族基因，其中有些基因可能参与红霉素生物合成。

发明内容

本发明目的就是通过增加糖多孢红霉菌中正向调控基因SACE_7301拷贝，提高红霉素产量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种构建红霉素高产菌株的技术方法，所述的方法为：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌SACE_7301基因拷贝数增加或提高SACE_7301基因表达量，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。

以SACE_7301为出发点构建红霉素高产菌株的技术方法，其特征在于以糖多孢红霉菌SACE_7301基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或中间产物。

本发明的优点是：

本发明研究中筛选到了红霉素生物合成正向调控子SACE_7301，通过基因工程途径增加糖多孢红霉菌染色体上SACE_7301基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。

糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_7301基因时红霉素产量降低了34.5%，而在ΔSACE_7301基因突变株中回补SACE_7301基因，红霉素产量部分恢复，表明SACE_7301是一个参与红霉素生物合成的正向调控子。当在糖多孢红霉菌A226中增加SACE_7301基因拷贝时，红霉素产量较出发菌株提高9.5%，说明在糖多孢红霉菌中提高SACE_7301基因拷贝，可以构建红霉素高产菌株。

同时，红霉素生物合成基因调控是一个网络，通过基因工程途径改变SACE_7301基因或产物的上下游调控因子，也可构建红霉素高产菌株，用于提高发酵红霉素产量。

附图说明

图1为染色体同源重组技术示意图

硫链丝菌肽抗性基因(tsr)替换了糖多孢红霉菌A226染色体上SACE_7301基因；

图2为SACE_7301基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置及编码氨基酸序列

参见 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=SACE_7301及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/134096620?report=genbank&from=8107531&to=8108388)；

图3为ΔSACE_7301突变体鉴定及红霉素产量分析