[发明专利]一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及乳酸菌发酵领域，特别涉及一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法。

背景技术

随着水产养殖业的迅猛发展，乳酸菌制剂以其天然、无毒、无副作用、无污染、无残留、安全可靠的优越性越来越受到重视。作为一种有益的净化水质的“生物修复剂”，乳酸菌制剂在水产养殖业的应用越来越受到重视，其应用于水产养殖业主要集中于拌料投喂、发酵饲料及作为EM菌主导菌在水体泼洒。其中拌料投喂、发酵饲料研究集中于乳酸菌在水产动物肠胃栖息，及调节动物肠道菌群结构和对饲料结构的改变。泼洒调节水质与乳酸菌可以调节养殖水体、改善养殖环境，抑制病原菌，抗病害，提高免疫力、促进动物生长有着密切的关系。这些应用与乳酸菌以下特性关系密切：首先，乳酸菌能很好适应水产养殖环境。水产养殖在养殖期间环境温度变动范围为20-35℃、盐度变动范围为0-38、pH值变动范围为6.9-8.7，在这三者变动范围内乳酸菌均能较好生长。其次，乳酸菌大部分的菌种属耐氧性厌氧菌，在无氧、低氧或高氧条件下均生长，不仅不与养殖动物竞争氧气，而且还能在溶氧量较低的水体中下层大量生长繁殖，抑制病原菌滋生。另外，乳酸菌在使用上不受时间限制，暴雨、阴天、晴天、高温条件下都可以使用。此外，乳酸菌作为一种最早使用的益生菌，与其它菌种相比，其菌体和代谢产物都为有益物，无毒素，实际应用中具有较高的安全性。这些乳酸菌在水产上的应用上的这些优势使得乳酸菌在水产方面有着广泛的应用和研究。

但是，目前大部分的乳酸菌类微生态制剂包被的产品价格昂贵，使用成本非常高；而乳酸菌类微生态制剂水剂产品相对较便宜，但是大多数产品很不稳定，活菌数较低，储存周期很短，而且运输成本较高；固体和液体乳酸菌类微生态制剂产品目前大多数采用发酵罐进行发酵，一方面生产工艺要求严格，需要专业的技术人员才能操作；另一方面，发酵罐的成本较高。

发明内容

本发明提出了一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，解决了现有技术中的不足，是一种培养设备及操作都很简单，而且储存时间和单一菌株发酵水剂相比很稳定的乳酸菌微生态制剂的制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2-5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂。

进一步的，所述纯化选育出的乳酸菌菌株为四株。

其中，所述的乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株若干株，经过两次分离纯化后待用；将分离纯化后的若干株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在30℃-37℃温度下培养46-50小时后吸取菌液在5000rpm下离心10-15min，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD_543mn的吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，一般吸光度在0.8-1.2之间时，把所有的稀释菌液按相同的体积比3-5%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，30℃-37℃下静置培养24-48h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD_543nm，选出8-12株的OD_543nm测定值高的菌株，这个OD_543nm测定值在0.5-1.0之间；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为24-48h,温度为30℃-37℃，选出计数结果高的菌株，最终选出四株乳酸菌菌株分别保种，一般计数结果的活菌数在10⁹CFU/mL都可以进行保种。

上述MRS液体培养基的重量份组成为：大豆蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-0.6份，葡萄糖1.5-2.5份，磷酸氢二钾0.1-0.3份，乙酸钠0.3-0.7份，柠檬酸三铵0.1-0.3份，硫酸镁0.05-0.06份，硫酸锰0.02-0.03份，吐温0.05-0.15份，蒸馏水99-101份。

上述的含碳酸钙的MRS固体培养基是在MRS液体培养基中按蒸馏水的重量加入1.5-1.8%的琼脂粉和1-1.2%的碳酸钙。