[发明专利]用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱及其制备方法。

背景技术

羊泰勒虫病（Ovine and caprine theileriosis ）是由媒介蜱传播的由泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称。羊泰勒虫病最早在1914 年发现于埃及绵羊。我国最早在1958 年由杨辅国等报道了四川的羊泰勒虫病，随后在青海、甘肃、辽宁、内蒙古、陕西和宁夏等地也有本病流行的报道。最近，在我国湖北、广东、浙江、贵州、新疆等省也检测到羊泰勒虫病原体。本病主要呈地方性流行，发病率高达36.0%-100%，病死率高达17.8%-75.4%。该病危害严重，可引起羔羊和外地引进羊大量死亡，使慢性发病的山羊和绵羊发育迟缓，产肉量和产毛量显著下降，从而给全球养羊业造成重大经济损失。

羊泰勒虫裂殖子的分离纯化一直是造成许多相关研究停滞不前的重要原因，任何非虫体来源的物质都有可能对其研究产生严重偏差，例如，羊泰勒虫蛋白质组全谱分析、差异蛋白分析与研究、转录组学的相关研究等，这都对羊泰勒虫的分离纯化技术提出了更高的要求。

目前，国内外的学者已经建立了一些分离微小寄生虫的方法，例如，利用纤维素滤膜过滤法纯化弓形虫速殖子（方正明，2010），虽然能分离到较纯净的虫体，但回收率太低，且存在滤膜易破、分离量少等缺点。Sugimoto等用溶血素法裂解感染瑟氏泰勒虫的牛红细胞，再通过Percoll 密度梯度离心来回收牛瑟氏泰勒虫，虽然可以大量的纯化虫体，但纯化产物中往往混有较多杂质，并且虫体易破损，造成蛋白损失，严重影响后续的实验进展。利用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子（李有全，2007），虽然纯化效果较好，但是工作量大，步骤繁琐也使得虫体的大量纯化较难进行。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱及其制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种用于分离纯化羊泰勒虫裂殖子的免疫亲和层析柱的制备方法，包括以下步骤：

（1）抗体的纯化：

利用protein G层析柱纯化血清抗体：将填料与结合缓冲液按照1:1体积比例预混后缓慢装入层析柱中，待填料充分沉淀后按照流速1 ml/min加5 ml结合缓冲液来平衡，将染虫绵羊血清按照流速1 ml/min加入到制好的层析柱中，收集流出液；用30 ml结合缓冲液按照流速2 ml/min过柱，待完全清洗后，用10-15 ml洗脱缓冲液按照流速1 ml/min过柱，收集流出液，SDS-PAGE验证纯化效果；用平衡缓冲液平衡柱子，以备下次使用；

所述结合缓冲液：20 mmol/L磷酸氢二钠，0.15 mol/L 氯化钠，pH 8.0；

所述洗脱缓冲液A：0.1 mol/L 甘氨酸，pH 2.5；

所述平衡缓冲液： 1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5；

（2）抗体的上样前处理：

用20 ml偶联缓冲液清洗脱盐柱，加入3 ml纯化的IgG过柱脱盐，收集流出液，将1/10流出液质量的氧化剂偏高碘酸钠固体粉末加入到样品中进行氧化处理，室温振荡1 h，立即再次进行脱盐处理；所述脱盐柱：聚丙酰胺凝胶介质；

（3）抗体的偶联：

吸取2 ml Affi-Gel凝胶至15 ml管中，完全沉淀后移除上清液，加10 ml偶联缓冲液，混合均匀，待凝胶完全沉淀后，移除上清液，重复上述清洗过程；清洗完成后，再次加入5 ml偶联缓冲液，将其转移至偶联柱中；加抗体至偶联柱中，室温振荡偶联24 h，收集流出液检测偶联率；用1倍柱容量的PBS清洗偶联柱，将偶联完成的偶联柱放入4℃保存备用；所述偶联缓冲液：100 mmol/L 醋酸钠、100 mmol/L 氯化钠，pH 5.5。

应用本发明的免疫亲和层析柱，从镜检图中看出，视野中分散着纯化后的羊泰勒虫裂殖子，无其他杂质存在，且细胞形态完整独立，因此本发明对于羊泰勒虫裂殖子的纯化有较好的效果。

附图说明

图1：利用protein G 提纯IgG后的SDS-PAGE电泳图；

图2：虫体纯化后1000倍油镜镜检图；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

免疫亲和层析柱的制备方法：

（1）抗体的纯化：

利用protein G层析柱（购自南京金斯瑞生物科技有限公司）纯化血清抗体。