[发明专利]人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列及其克隆方法

权利要求书

1.一种人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列，其特征在于：该cDNA全长序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

3.一种权利要求1所述的人EBLN-1基因cDNA全长核苷酸序列的克隆方法，包括如下步骤：

（1）从人少突胶质瘤细胞株中提取总RNA；

（2）3’末端序列的扩增：

以步骤（1）中的总RNA为模板，使用3’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一条链；

以cDNA第一条链为模板，利用3’-外引物、3’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’RACE外引物、3’-内引物和3’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的3’RACE内引物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物Ⅰ，所述3’-外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，3’-内引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；

将PCR扩增产物Ⅰ克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列；

（3）5’末端序列的扩增：

使用5’-RACE cDNA扩增试剂盒对步骤（1）中的总RNA进行去磷酸化处理和“去帽子”反应，得到mRNA，所述mRNA的5’端连接5’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’RACE Adaptor引物，然后进行反转录反应，得到反转录产物；

以所述反转录产物为模板，利用5’-外引物、5’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’RACE外引物、5’-内引物和5’-RACE cDNA扩增试剂盒提供的5’RACE内引物进行套式PCR扩增，获得PCR扩增产物Ⅱ，所述5’-外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，5’-内引物核的苷酸序列为SEQ ID NO.5；

将PCR扩增产物Ⅱ克隆入pMD19-T载体进行测序，得到人EBLN-1基因cDNA的5’末端序列；

（4）根据所述人EBLN-1基因cDNA的3’末端序列和5’末端序列，以及公开的人EBLN-1基因cDNA的部分序列拼接得到人EBLN-1基因的cDNA全长序列。

4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：步骤（2）所述套式PCR扩增的扩增体系为：

3’第一轮PCR 反应体系50 μl包括如下成分：步骤（2）的反转录反应液 2 μl，1×cDNA 稀释缓冲液II 8 μl，10 μM的3’-外引物2 μl，10 μM 的3’ RACE外引物2 μl，10×LA PCR 缓冲液II 4 μl，25 mM的 MgCl₂ 3 μl，5 U/μl的TaKaRa LA Taq 0.25 μl，dH₂O 28.75 μl；

反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，20 个循环；72℃ 10分钟；

3’第二轮PCR反应体系50 μl包括如下成分：3’第一轮PCR产物1μl，dNTP 8 μl，10×LA PCR缓冲液II 5 μl，25 mM 的MgCl₂ 5 μl，5 U/μl的TaKaRa LA Taq 0.5 μl，10 μM的3’-内引物 2μl，10 μM的3’ RACE内引物 2 μl，dH₂O  26.5 μl；

反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，30 个循环；72℃ 10分钟。

5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：步骤（3）所述套式PCR扩增的扩增体系为：

5’第一轮PCR 反应体系50 μl包括如下成分：步骤（3）的反转录反应液 2 μl， 1×cDNA 稀释缓冲液II 8 μl，10μM的5’-外引物2 μl，10μM的5’RACE外引物 2μl，10×LA PCR 缓冲液II 4μl，25 mM 的MgCl₂ 3μl，5 U/μl的T aKaRa LA Taq 0.25μl，dH₂O 28.75 μl；

反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，20个循环；72℃ 10分钟；

5’第二轮PCR反应体系50μl包括如下成分：5’第一轮PCR 产物1μl，dNTP 8 μl，10×LA PCR缓冲液II 5μl，25 mM的 MgCl₂ 5μl，5 U/μl  TaKaRa LA Taq 0.5μl， 10 μM的5’-内引物2μl，10 μM的5’ RACE 内引物2μl，dH₂ O 26.5μl；

反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 1分钟，25个循环；72℃ 10分钟。