[发明专利]裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法。

背景技术

裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.ex Am)为马鞭草科紫珠属多年生小灌木植物，主产于中国海南，广东、广西也有分布，国外主要分布在越南、马来西亚和印度。裸花紫珠是一种珍贵的药材，始载于唐《本草拾遗》，其根、茎、叶均可入药，有消炎、收敛、止血、清热解毒等功效。裸花紫珠用途广泛，其药用历史悠长，作用广且疗效显著，目前医用临床上有裸花紫珠胶囊、裸花紫珠片、裸花紫珠栓等成品药剂，此外，裸花紫珠还用于制作牙膏，其叶可直接泡水饮用。由于裸花紫珠种子出苗率低，扦插繁殖系数较小，基本上没有大面积种植，其生产原材料主要依靠采挖野生资源，随着市场需求量的逐年增加，野生资源的逐年锐减，已远远不能满足生产的需求。而且由于人为无度的大肆采收，资源破坏严重。因此，进行裸花紫珠的人工繁殖极有必要，而采用组织培养技术是最为有效的人工繁殖途经。目前，有关裸花紫珠的研究主要集中在化学成分、药理作用及临床应用上，利用种子和枝条进行人工繁育的报道极少，而裸花紫珠的组织培养和快速繁殖尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供了裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法，该方法操作简单、繁殖率高，可快速大量生产性状一致的裸花紫珠组培苗，解决了播种出苗率低，扦插繁殖系数小而致繁殖速度过慢问题。

　为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）材料与外植体消毒：选用裸花紫珠成熟种子，将裸花紫珠种子在自来水中清洗干净后用纱布包裹，在超净工作台上，先用浓度为75%酒精浸泡10 s，无菌水冲洗3次，再用浓度为0.1% HgCl₂溶液浸泡10 min，再用无菌水冲洗5次；

（2）种子诱导培养基的制备：以MS为基本培养基,添加蔗糖30 g/L、卡拉胶6 g/L，pH 5.8，配制后,于温度121℃、压力0.14 MPa高温高压灭菌20 min；

（3）种子的萌发：将已消毒好的种子接入步骤（2）种子诱导培养基中，培养25天后开始萌发，培养温度为24～28℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d；

（4）丛生芽的诱导：切取小苗上端约1.0 cm长转入增殖培养基中，28～30天可分化出5～6个芽，萌发出的新芽即可用解剖刀切分转入相同的培养基中进行增殖培养;增殖培养基为MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8；

（5）丛生芽继代增殖:丛生芽接入培养基MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L +蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，置于温度为24～28℃，光照强度为1500 lx的培养室中培养，光照时间8 h/d，继代时间为30～40 d；

（6）生根培养：将高度达到2 cm的小苗进行生根培养，培养基为MS+NAA 0.5～0.75 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，培养温度为24～28℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d；

（7）组培苗的炼苗与移栽：无根苗在生根培养基中培养30天后，苗高3～5 cm，根5条以上，将其移入拱棚内炼苗7～15天即可移栽;小苗从培养袋中取出后，用清水洗去根部残留的培养基，栽植于下列体积比为1:1:1混合基质中：河沙、珍珠岩和表土，种后浇透水，盖上透明塑料薄膜，注意遮阴， 20天揭去覆盖的透明薄膜，常规管理。

本发明提供了裸花紫珠高效快速组织培养的方法。该方法选取裸花紫珠的成熟种子，经初代培养形成不定芽，利用不定芽进行继代增殖及生根培养。采用此组织培养方法繁殖裸花紫珠，操作简单，繁殖率高，可快速大量生产性状一致的裸花紫珠组培苗，解决了播种出苗率低，扦插繁殖系数小而致繁殖速度过慢的问题。该技术可用于工厂化生产，将对裸花紫珠的保护、开发和利用提供有效的新途径，具有重要的经济、社会和生态效益。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1  材料与外植体消毒

材料为采自海南五指山的裸花紫珠成熟种子。将裸花紫珠种子在自来水中清洗干净后用纱布包裹，在超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，无菌水冲洗3次，再用0.1% HgCl₂溶液浸泡10 min，无菌水冲洗5次，然后将种子接种到诱导培养基上。

1.2  培养基