[发明专利]用于蛋白质衍生和缀合的活化的唾液酸衍生物

说明书

本申请是2006年2月16日提交的名称为“用于蛋白质衍生和缀合的活化的唾液酸衍生物”的200680012749.1发明专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及到化合物如聚唾液酸的衍生物，该衍生物具有末端唾液酸单元，且优选地基本只由唾液酸单元组成，在还原或非还原端有能与底物反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）基团，本发明也涉及到生产这些衍生物的方法。这些衍生物用于缀合含胺基基团的底物，如肽、蛋白质、药物、药物送递系统（如脂质体）、病毒、细胞（如动物细胞）、微生物、合成聚合物或共聚物等。 

背景技术

聚唾液酸（PSA）是由某些细菌菌株和哺乳动物某些细胞产生的天然存在的无支链的唾液酸聚合物[Roth et.al.,1993]。通过用神经氨酸酶进行有限的酸水解、消化作用或是通过分级分离天然的、细菌的或细胞来源形式的聚合物，可以产生各种聚合度的聚唾液酸：从n=约80或更多个唾液酸残基，低至n=2。不同PSA的组成也各异，所以存在同聚形式即α-2,8-连接PSA，包括大肠杆菌（E.coli）K1菌株和B群脑膜炎球菌（meningococci）的荚膜多糖，它也存在于胚胎形式的神经细胞粘连分子（N-CAM）中。也存在杂聚形式，如大肠杆菌K92菌株的α-2,8α-2,9交替连接的PSA和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)的C群多糖。此外，唾液酸也存在于与非唾液酸单体（如脑膜炎奈瑟氏菌的W135群或Y群）形成的交替共聚物中。PSA具有重要的生物学功能包括病原菌对免疫和补体系统的逃逸，以及胎儿发育过程中对未成熟神经元的神经胶质粘连性的调控（其中该聚合物具有抗粘连的功能）[Muhlenhoff et.al.,1998;Rutishauser,1989;Troy,1990,1992;Cho and Troy,1994]，但在哺乳动物中没有已知的PSA受体。大肠杆菌K1菌株的α-2,8-连接PSA也称为‘多聚乙酰神经氨酸’（colominic  acid）并且用于（以各种长度）阐述本发明。 

在细菌多糖中，甚至当缀合到免疫原性载体蛋白时，PSA的α-2,8-连接形式也是独特地非免疫原性的（在哺乳动物受试者中既不引起T细胞应答也不引起抗体应答），这种缀合形式可能反映了其作为哺乳动物（以及细菌）聚合物的存在。较短形式的聚合物（最高到n=4）存在于细胞表面神经节苷脂上，广泛分布于身体中，并且被认为有效地加强和维持了PSA的免疫耐受性。近些年，PSA的生物学性质，特别是α-2,8-连接的同聚PSA的生物学性质，被用于改变蛋白质和低分子量药物分子的药代动力学性质[Gregoriadis,2001;Jain et.al.,2003;US-A-5846,951;WO-A-0187922]。许多治疗型蛋白包括过氧化氢酶和天冬酰胺酶的PSA衍生化[Fernandes and Gregoriadis,1996and1997]使循环半衰期和它们的稳定性得到了显著的提高，并且使得在应用这些蛋白质时不用考虑已经存在的抗体，这些抗体是先前暴露于该治疗型蛋白而产生的一种不需要的（而且有时是不可避免的）结果[Fernandes and Gregoriadis,2001]。在许多方面，聚唾液酸化蛋白的修饰后的性质同聚乙二醇（PEG）衍生蛋白相近。例如，在所有情况下，半衰期都增加了，而且蛋白质和肽对于蛋白水解消化作用更加稳定，但是PSA对生物活性的保持似乎比PEG更强[Hreczuk-Hirst et.al.,2002]。而且，PEG用于必须长期给药的治疗药剂中时存在问题，因为PEG生物降解非常缓慢[Beranova et.al.,2000]而且其高和低分子量形式都倾向于在组织内蓄积[Bendele,et.al.,1998;Convers,et.al.,1997]。人们发现聚乙二醇化蛋白会导致产生抗PEG抗体，这些抗体会影响血液循环中该缀合物的停留时间[Cheng et.al.,1990]。尽管PEG作为与治疗剂缀合的肠道外给药的聚合物有着成熟的历史，还需要对其免疫毒理学、药理学和代谢有更好的理解[Hunter and Moghimi,2002;Brocchini,2003]。同样的，在要求高给药量的治疗药剂中应用PEG（因此最终导致高剂量的PEG）也存在顾虑，因为PEG的蓄积会导致毒性。因而α-2,8-连接PSA成为了使人关注的PEG替代物，它作为人体的天然部分是免疫系统“不可见”的生物可降解聚合物，而且可由组织神经氨酸酶降解为唾液酸，而唾液酸是一种无毒的糖类。