[发明专利]金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫制剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫制剂及其制备方法和药物的用途。

背景技术

葡萄球菌可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。引起食物中毒的主要是金黄色葡萄球菌产生的肠毒素。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）广泛存在于空气、土壤、水及物品。在人和家畜的体表及与外界相通的腔道，检出率也相当高。葡萄球菌的抗原结构较复杂，细胞壁经水解后，用沉淀法可得到两种抗原成分，即蛋白质抗原和多糖类抗原。蛋白质抗原主要为葡萄球菌A蛋白（Staphylococcus protein A,简称SPA），是一种表面抗原，从人分离到的菌株均有SPA，来自动物的少见。90%以上的金黄色葡萄球菌有此抗原，因而只具有种的特异性而无型的特异性。SPA的分子质量为13000-42000μ，它能与人及哺乳动物血清中IgG的Fc片断发生非特异性结合。多糖类抗原为存在于细胞壁上的半抗原，是该菌的一个重要抗原，有型特异性。其抗原决定簇为磷壁酸中核糖醇单位，此抗原可用于该菌的分型。金黄色葡萄球菌采取噬菌体分型共分5个群。金黄色葡萄球菌在生长繁殖过程中还产生多种毒素和酶，其中主要有溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、DNA酶、耐热性核酸酶和透明质酸酶等。

在无芽孢的细菌中，葡萄球菌的抵抗力最强。在干燥的浓汁中可生存数月，湿热80℃、

30min才能将其杀死。耐盐性强，在含盐7.5%-15%的培养基上能生长，但对燃料较敏感，如培养基中加入5×10^-6龙胆紫液可抑制其生长。对磺胺类药物敏感性较低，红霉素、链霉素、氯霉素及四环素较敏感。肠毒素的耐热性强，食物中毒素煮沸120min方能破坏，故一般的消毒及烹调不能破坏。低温下2个月以上失去毒力，可抵抗0.3%福尔马林达48h，pH3-10不被破坏，但在0.915mg/L氯溶液中3min即可破坏。

金黄色葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal entertoxin B SEB）是一种单体蛋白，它的分子质量是28366Da，等电点pI为8.6。对于每个蛋白质的一级结构和氨基酸序列是不一样的。金黄色葡萄球菌肠毒素B的氨基酸数量是238。SEB毒素蛋白有大量的赖氨酸(13.4%)和天冬氨酸(10.1%)带负电的残基有36个(天冬氨酸+谷酰胺)带正电的残基(精氨酸+赖氨酸)是37个。SEB的原子数量是3922个,其与原子组成成分碳1269个,氢1932个,氮324个,氧387个,硫10个。一分子的SEB的三维结构包含两个区域，这些区域是通过6个残基延伸的loop连接；一区（30-120），二区（127-239）。一个长的α-螺旋跨过两个区域的分子中心。区域一包含一个β-圆柱体（包含β1，β2，β3，β4，β5股）和三个螺旋（α2，α3，和α5）。

一区发现了大量的可溶性狂犬病残基。通过不同的β回转，β1与β2股和β2与β3两个半胱氨酸残基（半胱氨酸93和半胱氨酸113）在β圆柱体的上方形成一个的二硫化物键。两个半胱氨酸残基之间的序列形成一个能移动的、可溶的loop。

SEB的二区和其他微生物的超抗原是不一样的。它包含逆向平行的β折叠（β6-β12股）包着处于中心的α螺旋，β6股逆向平行β7，β7平行β12；β9逆向平行β12和β10。最近有关报道了二区可能结合p85蛋白质。N端尾部（残基1到20）在二区的表面。残基14到17 在二区的顶部形成一个310-螺旋回转（作为α1螺旋被标记）。葡萄球菌核酸中发现了OB-折叠，并在一些毒素和无关序列的非毒素蛋白质中出现。在蛋白质进化的过程中关于OB-折叠提出了很多观点。OB折叠在超抗原进化过程中是否结合二氧化碳分子仍然没有阐明。尽管这样，一个半乳糖类似物即半乳糖神经酰胺（半乳糖α1-4半乳糖β1-1神经酰氨）已经被证明作为SEB受体起到重要作用。SEB结合MHC??的亲和力很高（K_d-10^-6），它能结合小鼠的T细胞Vβ3，7，8.1，8.1，8.3，和17。根据SEB的拓扑异构和突变研究，T-细胞受体结合部位被SEB区域1和区域2形成的浅槽包围。SEB分子中α5螺旋，面对着结合MHC??分子的邻近位点。

SEB是一种热稳定蛋白。由于最开始过快的加热，在高温条件下会造成SEB活性的减弱。当毒素在PH7.3，100℃，加热5min，它的活性损失少于50%。SEB会抵抗变性剂的变性作用，比如尿素和盐酸胍。