[发明专利]甘露聚糖酶及其突变体

说明书

本申请是申请日为2011年8月16日、申请号为201110234218.X、“甘露聚糖酶及其突变体”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及甘露聚糖酶及其突变体，属于微生物工程技术领域。

背景技术

β-1, 4-D-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）又称为甘露聚糖酶，它能水解含有β-1, 4-D-甘露糖苷键，生成甘露寡糖或甘露多糖，属于半纤维素酶类。

在自然界中，甘露聚糖是仅次于纤维素的第二大可再生的半纤维素碳水化合物，广泛存在于植物细胞壁，尤其是在豆科植物种子中，半乳糖-甘露聚糖含量高达干重的20%以上。同时，甘露聚糖的结构也有很多种，如半乳糖-甘露聚糖、葡萄糖-甘露聚糖和半乳糖-葡萄糖-甘露聚糖等。半乳糖-甘露聚糖的结构是主链由β-1, 4-D-甘露糖苷键连接而成的甘露聚糖，侧链则是α-1, 6-半乳糖苷键连接的半乳糖。葡萄糖-甘露聚糖主链是由β-1, 4-D-甘露糖苷键连接而成，但其主链上一些甘露糖被葡萄糖取代。

半纤维素酶，包括甘露聚糖酶、木聚糖酶和葡聚糖酶等，广泛用于纤维素生产乙醇、食品、饲料和造纸等行业。饲用酶制剂要适应动物如猪和禽类等的消化道特点，需要具有耐酸性强，同时在pH6.0~7.0范围活性最强等特点。大豆粕是生产饲料的重要原料，如果在饲料中添加适量甘露聚糖酶，既能提高饲料的消化率，又能降低饲料成本（杨鸿昆等，2007，饲料研究；段蕾等，2008，饲料研究；范志恒，2008，饲料工业）。

很多微生物能产甘露聚糖酶，包括曲霉，芽孢杆菌甚至是链霉菌等。但是，通过菌种的筛选和诱变选育的自然菌株所产的甘露聚糖酶的酶活水平≤100U/ml，往往不能满足工业生产的需要（杨文博，1995，微生物通报）。因此，克隆基因进行异源表达而获得高效表达工程菌是当前开发甘露聚糖酶的热点（丁宏标等，2006，畜牧与饲料；谭秀华等，2005，微生物学报）。

作为饲料添加剂，寻找高酶活、耐酸和最适温度接近体温的甘露聚糖酶是当前研究的热点和难点。而蛋白质工程改造是获得理想蛋白的重要手段之一。定向进化是获得理想的饲用甘露聚糖酶的重要手段（毛绍名等，2007，微生物通报）。定向进化是利用随机突变而筛选大量突变体来获得目的蛋白，其工作量大，偶然性也非常大（张红缨等，1999，科学通报；许钦坤等，2005，生物技术通讯）。而理性设计虽然工作量相对较小，但是往往难于找到合适氨基酸位点进行突变改造（张秀艳等，2006，生物工程杂志；王凡业等，2006，应用化工）。

本发明提供了pH偏中性的甘露聚糖酶及其多个酶的突变体。这些突变体是从地衣芽孢杆菌的不同菌株中克隆得到，它们间不完全同源，同源性为99%。尽管这些突变体的同源性非常高，但是彼此间活性（比活）存在很大的差异。这说明这些突变/取代位点是影响其活性的关键位点，这为甘露聚糖酶的定向进化和理性设计通过提供了可供选择的关键位点和方向。

发明内容

本发明的目的是提供高酶活的甘露聚糖酶及其变体。

本发明提供了新的重组甘露聚糖酶及其突变体，其中所述重组甘露聚糖酶的氨基酸序列：

（a）     包含选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 12其中之一；或者

（b）    是在选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 12其中之一上取代、缺失或添加一个或数个氨基酸残基得到。

在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。

在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 4，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 3。

在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 6，，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 5。

在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 8，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 7。

在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 10，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 9。

在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 12，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 11。