[发明专利]一种细胞共培养诱导干细胞体外定向分化的方法

权利要求书

1.一种细胞共培养诱导干细胞体外定向分化的方法，其特征在于：在培养皿底部装一环形垫片，先将干细胞接种在环形垫片所形成的环形区域之内，置于培养箱内培养，待细胞贴壁后再将琼脂糖/海藻酸钠混合溶液加到该环形区域，使混合溶液液面高度超过垫片厚度大于或等于2mm；之后于环形垫片上平铺一个玻璃板，将玻璃板紧密压在垫片之上，待环形垫片内的混合溶液固化后，揭去玻璃板，加入CaCl₂溶液进行钙化，之后加入壳聚糖溶液进行反应，从而在干细胞之上形成了一层琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶；然后在平板复合凝胶表面接种诱导细胞，从而在同一个培养体系中实现了干细胞和诱导细胞的非接触共培养，通过改变琼脂糖/海藻酸钠混合溶液中琼脂糖的质量浓度以及环形垫片的厚度可改变平板复合凝胶的刚度、厚度以及诱导细胞分泌的可溶性因子在复合凝胶中的浓度，进而调控干细胞的体外定向分化。

2.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述环形垫片包括金属垫片或非金属垫片，其厚度为10-3000μm。

3.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述干细胞包括胚胎干细胞、iPS细胞、间充质干细胞、神经干细胞、虹膜色素上皮细胞、羊膜上皮细胞、或造血干细胞，诱导细胞包括分离培养的体细胞或细胞系；

干细胞和诱导细胞可以是同源同种细胞、同源异种细胞、异源异种细胞；

调控干细胞向神经细胞分化的诱导细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、髓鞘细胞、或神经组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向心肌细胞分化的诱导细胞包括；原代心肌细胞或心肌细胞系；

调控干细胞向肝细胞分化的诱导细胞包括原代肝实质细胞、原代内皮细胞、内皮细胞系、肝星状细胞、成纤维细胞、3T3细胞系、或肝组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向胰岛细胞分化的诱导细胞包括原代胰岛或β-胰岛细胞；

调控干细胞向成骨细胞分化的诱导细胞包括原代成骨细胞或骨组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向软骨细胞分化的诱导细胞包括原代软骨细胞或软骨细胞系；

调控干细胞向脂肪细胞分化的诱导细胞为原代脂肪细胞。

4.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述琼脂糖/海藻酸钠/壳聚糖平板复合凝胶为由琼脂糖、海藻酸钠和壳聚糖所制备；

琼脂糖为Ⅰ型，电内渗值小于0.2；

海藻酸钠的分子量为100-1000kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)为0.2-3，且海藻酸钠为未修饰海藻酸钠、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD）修饰海藻酸钠、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV）修饰海藻酸钠、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸（YIGSR）修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠；

壳聚糖分子量为2-200kDa,脱乙酰度为50-100%，所使用的溶液浓度为0.02-0.5%(W/V)。

5.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述琼脂糖/海藻酸钠混合溶液中琼脂糖质量浓度为0.1-6%(W/V)，海藻酸钠质量浓度为0.1-3%(W/V)。

6.按照权利要求1、4或5所述的培养方法，其特征在于：

所使用的琼脂糖/海藻酸钠混合溶液、100mmol·L^-1CaCl₂溶液以及壳聚糖溶液的体积比为1:10:5。

7.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述改变平板复合凝胶的刚度为通过改变琼脂糖的质量浓度来实现，其刚度为0.2kPa-80kPa。

8.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述改变平板复合凝胶的厚度为通过改变环形垫片的厚度来实现，其厚度为10-3000μm。

9.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述定向分化包括干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨、或脂肪组织的细胞定向分化。