[发明专利]一种根癌农杆菌介导的大麦叶基转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及以大麦叶基为外植体材料诱导愈伤，以根癌农杆菌介导的培育转基因植物的方法。本发明涉及大麦叶基材料制备及诱导愈伤方法，经根癌农杆菌介导，用于大麦栽培品种的遗传转化。

背景技术

大麦是世界上最重要的作物之一，其种植面积和产量仅次于水稻、小麦和玉米之后，位于禾谷类作物第四位，主要用作粮食、饲料、啤酒工业原料以及医药工业原料和保健食品等。大麦的遗传改良一直倍受重视。

Tingay等于1997年首次以农杆菌介导法成功转化大麦幼胚，获得转基因大麦植株，随后农杆菌介导的转化方法逐步发展成为大麦遗传转化的重要方法(Tingay S，McElroy D，Kalla R，Fieg S，Wang M，Thornton S&Brettell R.Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation.J Plant，1997，11：1369-1376；McCormac A C，Wu H，Bao M，Wang Y，Xu R，Elliott M C&Chen D F.The use of visual marker genes as cell-specific reporters of Agrobacterium-mediated T-DNA delivery to wheat(Triticum aestivum L.)and Barley(Hordeum vulgare L.).Euphytica，1998，99：17-25；Matthews P R，Wang M B，Waterhouse P M，Thornton S，Fieg S J，Gubler F，Jacobsen J V.Marker gene elimination from transgenic barley，using co-transformation with adjacent‘twin T-DNAs’on a standard Agrobacterium transformation vector.Mol Breeding，2001，7：195-202；Murray F，Brettell R，Matthews P，Bishop D，Jacobsen J.Comparison of Agrobacterium-mediated transformation of four barley cultivars using the GFP and GUS reporter genes.Plant Cell Rep，2004，22：397-402；Wu H，McCormac A C，Elliott M C，Chen D F.Agrobacterium-mediated stable transformation of cell suspension cultures of barley(Hordeum vulgare L.).Plant Cell Tiss.Org.Cult，1998，54：161-171；Trifonova A，Madsen S，Olesen A.Agrobacterium-mediated transgene delivery and integration into barley under a range of in vitroculture conditions.Plant Sci，2001，161：871-880；Fang Y D，Akula C，Altpeter F.Agrobacterium-mediated barley(Hordeum vulgare L.)transformation using green fluorescentprotein as a visual marker and sequence analysis of the T-DNA::barley genomic DNA junctions.JPlant Physiol，2002，159：1131-1138；Travella S，Ross S M，Harden J，Everett C，Snape J W，Harwood W A.A comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment and Agrobacterium-mediated techniques.Plant Cell Rep，2005，23：780-789；Kumlehn J，SerazetdinovaL，Hensel G，Becker D，Loerz H.Genetic transformation of barley(Hordeum vulgare L.)via infection of androgenetic pollen cultures with Agrobacterium tumefaciens.Plant Biotechnol J，2006，4：251-261；Inger BAksted Holme，Henrik Brinch-Pedersen，Mette Lange，Preben Bach Holm.Transformation of different barley(Hordeum vulgare L.)cultivars by Agrobacterium tumefaciens infection ofin vitro cultured ovules.Plant Cell Reports，2008，27，1833-1840)。然而，Tingay等采用的方法是先以基因枪轰击大麦幼胚诱导的愈伤组织，再以农杆菌进行转化。虽然获得了转基因植株，但实验难度大、成本高。同时，在大麦的农杆菌介导转化中，目前存在的突出问题就是以开花后15天左右的幼胚为转化受体，利用模式品种Golden promise转化，而以栽培大麦品种开展转化的研究受到限制，转化频率也不高。在实际工作中，大麦生长周期长，从播种至幼胚形成需要约150天，田间一年仅能取材一次，因此，幼胚取材是目前大麦遗传转化研究的最主要限制因素之一。本发明从最关键的转化受体入手，发明了用大麦籽粒直接萌发幼苗，以幼苗叶基为受体用于转化，进一步优化了由叶基诱导愈伤、农杆菌浸染及转基因材料筛选、鉴定过程中的关键问题，从而建立了一种高效的根癌农杆菌介导的大麦叶基愈伤的遗传转化方法。