[发明专利]一种曲普瑞林的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽药物的纯化方法，特别涉及曲普瑞林的纯化方法，属于药物化学领域。

背景技术

曲普瑞林，英文名：Triptorelin，商品名为色氨瑞林、达必佳、Decapeptyl等，为10个氨基酸组成的一种促性腺激素释放激素(GnRH)十肽同类物，其结构类似戈舍瑞林，其肽序为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂，临床用其双羟萘酸盐(储存制剂)。

曲普瑞林作为一种妇科用药，其适应症主要为:1.晚期前列腺癌的姑息疗法；2.性早熟；3.子宫内膜异位、女性不孕症和子宫肌瘤。以治疗剂量持续给药时，本品能强有力地抑制促性激素的分泌，其活性比天然的GnRH强。开始给药后，血循中的LH,FSH，睾酮以及雌二醇的水平会出现短暂性高峰。在连续长期给药后，一般在开始治疗的2～4周可观察到LH和FSH的分泌量持续下降以及睾丸和卵巢的类固醇合成明显减少。曲普瑞林是目前治疗中枢性性早熟最理想的药物，能迅速有效地抑制第二性征的成熟和身体呈直线生长的速度，停药后，青春期发育生物的自然过程不受影响。临床主要用于性早熟、子宫内膜异位症、女性不孕和子宫肌瘤等。

现有技术CN101357936A公开了一种曲普瑞林的分离纯化方法，具体步骤如下：将曲普瑞林粗品溶于5％乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5，体积比)；流速为500ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，约得20g白色块状物成品(MW：1311.5，15.25mmol)，总收率25.4％(以树脂的60mmol计)。该分离纯化方法难以控制原料的杂质限量，难以达到药用所需的纯度。

为有效控制曲普瑞林原料的杂质限量，提高纯度，需进一步研究新的分离纯化方法。

发明内容

本发明针对曲普瑞林的理化特征，提供了一种成本低廉、高收率、工艺过程简单、样品杂质少且稳定可控、有利于实现产业化的曲普瑞林纯化工艺。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种曲普瑞林的纯化方法，其特征在于：

1)以体积比含量5%—15%的有机溶剂的水溶液，按照浓度100g/L溶解曲普瑞林样品，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，以缓冲盐为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱（该步骤后述简称为“纯化”）；

2)采用反相HPLC方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，将曲普瑞林磷酸盐转成醋酸盐、冻干得到曲普瑞林（该步骤后述简称为“转盐”）。

步骤1），所述步骤1）中优选以体积比含量8%—10%的有机溶剂的水溶液，按照浓度100g/L溶解曲普瑞林样品，其中，所述的溶解样品所用的有机溶剂为极性较强的有机试剂，包括甲醇、乙腈、二甲基亚砜（DMSO）、异丙醇等，其中优选乙腈。

申请人发现，由于曲普瑞林本身结构组成的特征，粗品中容易含有各种合成不完全、或消旋化杂质，因此粗肽样品的溶解试剂要求很苛刻。经申请人反复试验后发现，有机溶剂含量在5%～15%范围内时，样品溶解性较好，其中有机溶剂含量在8%～10%范围时，效果更明显；而在摸索不同有机试剂时发现，DMSO、甲醇、乙腈、异丙醇等较强极性的有机试剂对样品的溶解效果较好，其中又以乙腈效果最佳。

其中，所述1）中A相的缓冲盐为磷酸缓冲盐或硫酸缓冲盐。

其中，所述的磷酸缓冲盐为0.1%—0.8%（v/v）磷酸盐缓冲液，缓冲液的溶剂为水；所述的硫酸缓冲盐体系为0.2%—0.6%（v/v）硫酸盐缓冲液。

其中，所述的磷酸缓冲盐包括磷酸三乙胺、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等缓冲盐体系；硫酸缓冲盐体系为硫酸铵缓冲盐。

在对曲普瑞林进行纯化过程中，申请人对不同流动相体系进行分析、对比，找寻最佳的流动相体系。过程中发现，大多数流动相体系只能单纯的除掉部分杂质，一次在纯化过程中为了保证纯度，往往要反复进行多次繁琐的回收纯化才能达到合乎要求的纯度；经过申请人的反复摸索，最终的0.1%—0.8%（v/v）磷酸盐缓冲体系和0.2%—0.6%（v/v）硫酸盐缓冲体系，对除去粗肽中的杂质效果明显，只需一次纯化、一次回收，省去多步重复操作。将纯化可以得到纯度大于95%，单杂小于0.3%的样品除去大部分乙腈后进行转盐。纯度小于95%大于80%的部分回收一次，取其中纯度大于95%，单杂小于0.3%的部分和其他合格品一起转盐，回收纯度不符合要求的废弃。