[发明专利]一种可被猪物种NF-κB转录因子所识别的DNA片段、重组载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，具体而言，涉及一种可被猪物种NF-κB转录因子所识别的DNA片段、重组载体及其应用。 

背景技术

NF-κB信号通路在猪抗病免疫反应中起着至关重要的作用。NFκB存在于绝大多数类型的组织和细胞，是一类非常关键的转录因子，并组成转录因子NFκB家族(Ghosh et al.，1998；Miyamoto and Verma，1995；Siebenlist et al.，1994)，哺乳动物中此家族的五位成员分别是：NFκB1(p50)，NFκB2(p52，p49，p50B)，RelA(p65)，c-Rel，RelB。所有成员都含有一个保守的由300个左右氨基酸组成的Rel同源区，该同源区是NFκB蛋白特有的功能域，负责形成二聚体，并与DNA识别位点及抑制蛋白IκB(inhibitor κB)结合(Baeuerle and Henkel，1994；Perkins，2007)。哺乳类动物中IκB家族成员有7个，分别是IκBα，IκBβ，IκBγ，IκBε，Bcl-3，p100和p105。通常情况下，NFκB家族是以同源或异源二聚体形式与IκB蛋白形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中。关于IκB蛋白与NFκB亚单位结合后阻止NFκB与靶基因调控区结合的机理业已阐明(Brasier，2006；DiDonato et al.，1996；Kl ement et al.，1996)：当IκB蛋白与NFκB p65亚基结合时，使p65的空间构象改变，p65亚基Ig样结构域的氨基末端旋转180°，从而使与靶DNA序列结合的关键氨基酸残基被屏蔽，从而抑制NFκB与靶基因调控区的特异性结合。而IκB蛋白N端第32、36位丝氨酸残基从NFκB-IκB复合物中位置凸出，极易被IκB蛋白激酶(IκB kinase，IKK)磷酸化，磷酸化的IκB进一步被蛋白酶体泛素化降解，使NFκB激活，从NFκB-IκB复合物中解离出并转位于细胞核，与相应的靶基因结合。但同时IκB在被降解后又可迅速再合成，并能进入细胞核与NFκB结合，而NFκB-IκB复合物的形成使NFκB从其所结合的DNA位点上脱离，并重新转移至细胞质，由此实现NFκB激活与失活的循环，完成NFκB作为一种转录因子的调控功能。 

目前国际学术界普遍采用知名生物技术公司(如Stratagene和Clontech)开发的商业化人用NF-κB报告载体作为各个哺乳动物中通用的研究工具，但其中所隐含的问 题仍不容忽视，原因在于：在不同的物种中，NF-κB转录因子所识别并结合的特异DNA序列不尽相同，因此人用NF-κB报告载体所得数据的灵敏性和稳定性不一定能够满足研究者的要求。如果能够开发出一套适用于猪的NF-κB报告系统，则可为猪的免疫学研究提供更为精细、可靠的工具。 

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可被猪物种NF-κB转录因子所识别的DNA片段和重组载体，以及该DNA片段作为调控猪物种NF-κB信号通路下游基因表达的启动子的应用、该重组载体作为检测猪物种NF-κB转录因子转录活性强度的报告载体的应用。 

本发明提供的DNA片段是由猪物种的多个NF-κB结合位点按不同顺序排列而成的核苷酸序列，并且具有启动子活性。本发明中的术语“启动子”系指DNA上一段序列，RNA聚合酶结合到该序列上，可以起始基因的转录。 

具体地，本发明的第一个目的是这样实现的： 

一种可被猪物种NF-κB转录因子所识别的DNA片段，其核苷酸序列是如下(1)或(2)： 

(1)序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列； 

(2)与所述(1)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。 

本发明的DNA片段还包括与来自序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。 

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列90％或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。