[发明专利]增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是一种增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB及其应用。

背景技术

细菌发光基因操纵子luxCDABE来源于Photorhabdus luminescens。因为检测灵敏方便而被作为报告基因广泛应用于基因表达分析、快速检测、有毒有害物质分析等领域。其中luxA和luxB基因分别编码细菌荧光素酶异二聚体的α（催化亚基，40kD）和β（调节亚基，36kD）亚基，只有两个亚基共存时才有活性，当将luxA和luxB基因融合表达后形成的单体蛋白仍然具有与野生型异二聚体蛋白相当的发光活性，经密码子优化后该融合蛋白在真核生物中也具有很高的活性。luxCDE编码脂肪酸还原酶和合成酶，用于合成细菌荧光素酶所作用的底物十四烷醛。为了克服真核生物来源荧光素酶报告系统需要外加底物的缺点，最近国外有研究人员通过将luxC、luxD和luxE基因在哺乳动物细胞中共表达成功构建了产细菌荧光素酶底物的稳定细胞系[30]，由于luxA和luxB基因融合型单体蛋白和非融合型二聚体蛋白均可在真核生物细胞系中功能表达，这一研究就此宣告了细菌荧光素酶真核活体实时自动化报告基因检测系统的成功，也为基于细菌荧光素酶的自动化双分子互补活体实时动态蛋白相互作用检测系统今后在真核生物中的应用提供了担保，奠定了基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB。

本发明的技术方案如下：

增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB作为生物发光报告基因的应用。

本专利申请发明人将luxA和luxB基因融合表达后形成的单体蛋白经过易错PCR突变和化学随机突变，克隆到pBluescriptII载体中，筛选得到9个荧光强度增强的突变体，然后经过shuffling技术，得到一个增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB。

附图说明

图1为pDM4-luxCDABE基因及MCS；

图2为pBluescriptII质粒图谱；

图3为luxA和luxB基因融合单体克隆示意图；

图4为易错PCR突变luxAB融合单体蛋白发光强度检测；

图5为shuffling过程图解；

图6为突变体经过shuffling后筛选结果；

图7为不同浓度的底物（十四醛）对细菌荧光素酶luxAB荧光强度的影响；

图8为增强型单体细菌荧光素酶luxAB基因在大肠杆菌E.coli DH5α荧光强度检测结果，pB-luxABs为增强型单体细菌荧光素酶的荧光强度，pB-luxAB是阴性对照组；

图9为增强型单体细菌荧光素酶luxAB基因在谷氨酸棒状杆菌中荧光强度检测结果，1组为增强型单体细菌荧光素酶的荧光强度，2组是阴性对照组；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

一.材料与方法

1.分子生物学试剂

各种限制性内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司，T4DNA连接酶为New England Biolab公司产品，DNA分子量标准：MakerIII和DL5000+2000购自天根生物科技（北京）有限公司。

研究中用到的抗生素浓度如下：氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素100μ g/mL，氯霉素30μg/mL，萘啶酸15μg/mL。培养大肠杆菌一律采用LB培养基：10%蛋白胨，5%酵母膏，10%NaCl；培养Yp采用YLB培养基：10%蛋白胨，5%酵母膏，5%NaCl。

2.实验材料：

大肠杆菌E.coli DH5α；YPIII假结核耶尔森氏菌菌株由英国诺丁汉大学购买；pDM4-lux Box（含有luxCDABE基因序列）由英国诺丁汉大学购买；质粒pBluescipt II购自大连宝生物公司（如图2）;质粒pKT25；pDM4均从天根生物公司购买。

3.克隆构建