[发明专利]一种免疫脂质体生物芯片、其制备方法及其在生物检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫脂质体生物芯片，同时本发明还涉及所述免疫脂质体生物芯片的制备方法及其在生物检测中的应用。

背景技术

抗体和其它细胞表面的配体已被广泛用于生物分析检测领域，如通过磁激活分选细胞（MACS），其中配体被固定到磁性纳米粒子上；另外，如通过荧光激活细胞分选（FACS），其中荧光染料标记的抗体被用来细胞分离，但是，荧光染色的抗体和固定化抗体的磁性纳米粒子昂贵且费时。对于混合细胞中的分离，近年来以固体基板为基础的细胞芯片分选方法是发展趋势，因为它们便于固载各种筛选细胞的表面配体如抗原等，同时具有配体及细胞使用量少的特点。

细胞芯片检测已被用于活癌细胞分析，如对白血病，前列腺癌的癌细胞，利用抗原特异性T细胞和干细胞上表达的特定的表面抗原进行细胞芯片分析。如CN101046448公开了一种利用一维微流控生物芯片检测细胞中基因突变的方法，将总RNA或靶DNA样品于包含有荧光探针的缓冲液中稀释，并在压力驱动下流过微通道进入功能化阵列，根据荧光强度的差别来判断该检测位点的突变类型。然而，它们的检测效率往往受限于靶细胞和芯片表面涂层的配体之间的弱结合力，以及与非靶细胞的非特异性结合。因此，在上述方法中，需要一个单独的检测方法来分析所捕获的细胞其内部的生物标志物。

基于脂质体的芯片，可以通过不同的方法制备。由于直接自组装在固体基板表面的脂质体并不稳定，许多研究者已经开发利用寡核苷酸束缚，生物素-链霉亲和素链接，抗原-抗体对，共价键等的替代方法。然而，这些制备方法其步骤复杂且所用的材料非常昂贵。

含有DNA和RNA的免疫脂质体的已被广泛作为靶向的纳米载体，用在体内外的基因治疗中。如CN101797229A公开了一种基于Isthmin基因的免疫脂质体的制备方法和应用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于制备抗肿瘤血管生成的药物。此外，用于检测在细胞中特定的mRNA和microRNA的分子探针如分子信标（MBS）和锁核酸（LNA）修饰的分子信标可以封装在免疫脂质体中，进行分子诊断。如CN101484139公开了以抗体靶向的免疫脂质体的制备及其应在全身诊断中的应用。

对各种疾病，包括癌症和传染性疾病的早期的方便、快速检测已经成为极其重要的研究方向。一种疾病越早被诊断，就越有可能被治愈。在过去的几十年，虽然已经取得了显著进步，但一些疾病，如艾滋病和癌症的死亡率并没有改变，其中一个重要的原因是在疾病的早期阶段，缺乏方便，快速，非侵入性的检测方法。对于许多感染性疾病，甚至是由病毒感染引起的癌症，目前的病毒检测方法，主要依靠检测针对病毒或病毒在感染细胞的遗传物质（病毒RNA或DNA）产生的抗体，如ELISA法，免疫印迹法和定量RT-PCR法。这些方法繁琐耗时。更重要的是，他们是间接的方法，不能直接检测病毒，防止感染。病毒的直接检测是非常重要的，因为原始感染后，它需要几周甚至几个月的时间，才会在血液或感染的细胞内出现针对病毒或病毒的遗传物质的抗体。在这个时间窗口期，受感染的人仍然可以传播疾病，因此需要直接和简单的检测方法，在早期对病毒进行捕获并鉴定，从而对传感染性疾病进行理想预警。

检测癌细胞血清或血浆中循环的microRNA可以作为一个有用的“液体活检”，用于癌症的早期检测和监控。循环miRNA一般被包装在外泌体中，保护它们免受内源性RNase活性酶的降解。循环外泌体中的microRNA已被用作检查癌症的重要指标。外泌体中microRNA的分离和表征涉及了一系列的离心分离步骤，一般通过在蔗糖梯度超速离心分离，但使用该方法很难获得高纯度的外泌体，且该方法耗时，不适用于在临床上的高通量分析。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种新的免疫脂质体生物芯片。本发明中，免疫脂质体被锚定在固体基板的表面形成微阵列，其中分子信标被封装在免疫脂质体内，和细胞表面的受体（如抗原）相结合的配体，插入到锚定的脂质体上的表面。由于抗体和脂质体的相互作用的增强，与传统的脂质体芯片，我们的免疫脂质体生物芯片具有较强的细胞结合强度，可达到较好的细胞分离效果和较低的抗体试剂消耗。本发明中的免疫脂质体生物芯片还可以被用于捕获和拣选病毒和细胞分泌的纳米粒子，如微泡和外泌体等。

本发明中内含分子信标的免疫脂质体生物芯片，可直接检测在所捕获的活细胞和病毒的核酸或蛋白质，也可测定细胞分泌的纳米粒子（如微泡和外外泌体）内的生物标志物。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：