[发明专利]鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统及其应用，特别涉及一种在野生型鼠肝炎冠状病毒A59株基因组中插入GFP后得到的重组鼠肝炎冠状病毒。

背景技术

冠状病毒是目前已知的基因组最大的单股正链RNA病毒，主要引起呼吸道和消化道的疾病，是多种经济动物传染性疾病的病原体，常常导致巨大的社会经济损失。自2003年一种新的SARS-CoV被确定为烈性传染病SARS的病原体以来，冠状病毒（Coronavirus）便成为全球生命科学研究的热点之一。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是来源于发光水母（aequorea victoria）的一种功能独特的蛋白质，分子量为27kD，由238个氨基酸组成。自1992年Prasher等克隆到GFP的cDNA以来，GFP示踪技术已广泛应用于分子生物学研究领域。结合GFP荧光示踪的技术手段，可分别在细胞和动物水平，对标记分子或物质进行荧光示踪监测和定量检测。

目前尚未有对鼠肝炎冠状病毒进行GFP示踪的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统及其应用。所述鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统即为一种表达绿色荧光蛋白的重组鼠肝炎冠状病毒。

本发明所提供的重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；

所述替换为：将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片段（可由1个、2个或更多个核糖核苷酸组成）替换为片段b；

所述插入为：在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；

所述片段a为序列表中序列1编码的RNA；所述片段b为含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段编码的RNA。

所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

在本发明中，所述绿色荧光蛋白的编码基因的序列为序列表中序列3的第142-861位。

进一步，所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。

在本发明的一个实施例中，所述野生型鼠肝炎冠状病毒具体为鼠肝炎冠状病毒A59株。

在本发明的一个实施例中，所述重组鼠肝炎冠状病毒是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换得到的重组病毒；具体的，所述替换中，所述“片段a中的任一片段”为所述片段a中的序列1的第468-765位核苷酸对应的RNA片段。

由于所述野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为NC_001846.1的序列（Up date：2012-8-23），相应的，所述重组鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为NC_001846.1的序列（Up date：2012-8-23）的第27967-28264位（对应序列1的第468-765位）替换为序列表中序列3，得到的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法。

本发明所提供的制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法具体可包括如下步骤：

（a）将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；

（b）用含所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒载体甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒载体甲中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；

（c）将步骤（b）中的所述重组痘苗病毒载体乙中的所述gpt基因替换为所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；