[发明专利]一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法

权利要求书

1.一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其特征是该方法包括如下步骤：

一、三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；

二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法。

2.根据权利要求1所述的一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其特征是所述的步骤一，三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；具体包括如下步骤，

1、实验材料：

1）底部带Teflon塞的玻璃瓶规格10cm×15cm；BT100-1L型蠕动泵连接管路均采用Teflon材料;树脂层析柱的规格为20mm×250mm; 树脂选用AB-8大孔中性吸附树脂；生长介质: 石英砂为白色，无其他杂色，石英砂粒径为0.5-1.0mm，玻璃珠粒径为10 mm，石英砂和玻璃珠的粒径比例为5∶1；

2）实验预培养15天龄的完整三叶鬼针草植株幼苗，茎高15cm，洗净营养土待用；

3）配置Hoagland’s原液5L，用去离子水稀释100倍为实验营养液，实验选用Hoagland’s配方pH=6.0，取各药品的质量浓度分别为：

硝酸钙浓度为945mg/L，硝酸钾浓度为506mg/L，硝酸铵浓度为80mg/L，磷酸二氢钾浓度为136mg/L，硫酸镁浓度为493mg/L，七水合硫酸亚铁浓度为3.45mg/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为4.66mg/L；

2、装置预处理：

1）将带Teflon塞的玻璃瓶、玻璃树脂层析柱和Teflon材料的连接管路用0.5%质量的盐酸浸泡24h；取出用去离子水冲洗，然后用洁净超纯水润洗12h；放入烘箱烘干；分别将带Teflon塞的玻璃瓶和玻璃树脂层析柱用黑色不透明胶纸把瓶身包裹，使瓶壁和柱壁不透光；

2）石英砂和玻璃珠均用去离子水浸泡24h，放入烘箱烘干待用；

3）AB-8大孔中性吸附树脂，首先，用0.5倍于树脂柱体积的分析纯无水乙醇润洗，然后将润洗后的AB-8大孔中性吸附树脂浸泡于无水乙醇中24h；其次，用2倍体积的无水乙醇冲洗浸泡后的AB-8大孔中性吸附树脂，直至AB-8大孔中性吸附树脂不再流出白色浑浊物为止；再次，用4-6倍体积的重量浓度为5%HCl溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h后用去离子水洗至中性；再用2倍体积的重量浓度为2%NaOH溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h，最后用去离子水洗至中性；

3、装置组装：

1）将15天龄的三叶鬼针草幼苗取出40株，放入事先放入玻璃珠的带Teflon塞的玻璃瓶内，用处理过的石英砂固定并包埋，加入稀释100倍的Hoagland’s营养液250mL；

2）用2倍体积的稀释100倍的Hoagland’s营养液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，然后接在带Teflon塞的玻璃瓶下；

3）用Teflon材料的连接管路将AB-8大孔中性吸附树脂与带Teflon塞的玻璃瓶相互连接，形成回路；

4）接入BT100-1L型蠕动泵，设置流速为5mL/min,保持实际滴速为30滴/min，打开各个阀门，打开蠕动泵，营养液开始循环，闭合回路开始工作。

3.根据权利要求1所述的一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其特征是所述的步骤二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法，具体如下步骤包括，

1）装置运行两天后，关闭阀门和蠕动泵，取下AB-8大孔中性吸附树脂；

2）每根AB-8大孔中性吸附树脂分别用分析纯甲醇溶液作为洗脱液，以2倍AB-8大孔中性吸附树脂体积的甲醇洗脱树脂；

3）平均每柱分析纯甲醇洗脱液为50mL，将洗脱液收集转移入心形瓶中；

4）将心形瓶接入BUCHI旋转蒸发仪上，BUCHI旋转蒸发仪设置的旋蒸气体为甲醇，恒定水温45℃，转速为BUCHI旋转蒸发仪上标注的2档，系统压强200-220mbar；

5）旋转蒸发洗脱液至其不再减少时停止旋蒸，将旋蒸后的洗脱液转移入50mL离心管中，用去离子水冲洗心形瓶；

6）将50mL离心管密封，放入-70℃的低温冰箱中冷冻，约72h后取出；

7）将50mL离心管放入Christ ALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥仪中，将固态水分全部抽出，得到粉末状的根系分泌物提取物；

实验得到根系分泌物的数据参考，每管为40个植株2天的根系分泌物收集量：

1号瓶处理前12.5222g，处理后12.5582g，有效质量0.036g；

2号瓶处理前12.1084g，处理后12.1434g，有效质量0.035g。