[发明专利]HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法

说明书

技术领域　

本发明涉及一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法。属于中药成分分析领域。 

背景技术

在现有技术中，苦碟子别名满天星，苦荬菜，主要分布于我国东北及内蒙古等地，为菊科植物抱茎苦荬菜(Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance)的当年生干燥全草，性寒，味苦、辛，具有清热解毒、排脓止痛之功效^[1]。苦碟子(碟脉灵)注射液是以苦碟子为原料提取精制而成的静脉注射液, 具有活血化瘀，改善微循环的作用^[2]。该注射液已上市多年，疗效确切。实验研究表明，苦碟子注射液化学成分比较复杂，而与其临床疗效相关的主要活性成分为核苷类、有机酸类和黄酮类成分。

苦碟子注射液（曾用名：碟脉灵注射液）列入国家药品标准产品（国药准字Z20025450），由通化华夏药业有限责任公司生产。

处方：抱茎苦荬菜1000g，制成1000ml。

制法：取抱茎苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，浓缩至每1ml相当于原生药0.5g，放冷至40℃以下，在搅拌下加10%氧化钙乳调节pH值至10，放置12小时，离心，离心沉淀物称重，悬浮于5.3倍量95%乙醇中（使含醇量达80%），加50%硫酸溶液调节pH值至3－4，充分搅拌使反应完全，离心，离心液加40%氢氧化钠溶液中和pH值至7.0，滤过，滤液回收乙醇，并挥尽乙醇，用注射用水稀释至每1ml相当于原生药4g，置-5℃以下放置12小时以上，滤过，滤液加0.1－0.2%药用活性炭粉末，煮沸15分钟，置-5℃以下放置24小时以上，滤过，滤液加注射用水稀释至规定量，调节pH值至7.0－7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。性状：本品为浅黄棕色至黄棕色的澄明液体。

含量测定：本品每10ml含总黄酮以无水芦丁（C₂₇H₃₀O₁₆）计，不得少于4.0mg。含抱茎苦荬菜以腺苷（C₁₀H₁₂N₅O₄）计，不得少于0.025mg。

功能主治：活血止痛，清热祛瘀。用于瘀血闭阻的胸痹，证见：胸闷、心痛，口苦，舌暗红或存瘀斑等。适用于冠心病、心绞痛见上述病状者。亦可用于脑梗塞者。

用法用量：静脉滴注，一次10－40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0.9%氯化钠注射液稀释至250－500ml后应用；14天为一疗程；或遵医嘱。

规格：每支装（1）10ml，（2）20ml，（3）40ml。

实验研究表明，苦碟子注射液化学成分比较复杂，而与其临床疗效相关的主要活性成分为核苷类、有机酸类和黄酮类成分。

核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA代谢过程，通过激活人体中的嘌呤受体发挥多种生理作用。如胞苷(cytidine)具有抗肿瘤和抗病毒等作用；尿苷(uridine)参与糖原合成，有助于提高细胞的耐缺氧能力，提高机体抗体水平，并可以阻断癌细胞和病毒的基因合成；鸟苷(guanosine)具有免疫调节的生理活性；特别是腺苷(adenosine)具有抗心肌缺血、抗凝血、抗炎、改善心脑血液循环、防止心率失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等作用，是苦碟子注射液质量控制的指标成分。因此，为了控制产品质量，对苦碟子注射液中的核苷类化合物建立快速、简便、准确的测定方法具有重要的实际意义。

目前，核苷类化合物含量测定方法主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相-质谱法、毛细管电泳法等。紫外法与薄层法特异性较差，液-质与毛细管电泳法对仪器要求较高。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种采用HPLC-DAD技术建立同时测定10种核苷类化合物(5种核苷：尿苷、腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和5种碱基：尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶) 成分含量的分析方法，并应用该方法测定苦碟子注射液中主要核苷类化合物的含量，以期为注射液水溶性成分的进一步研究奠定基础，同时为其质量控制提供方法学参考依据。

本发明的技术解决方案是：HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中10种核苷类成分含量的方法，其步骤如下：

（1）混合对照品溶液的配制：