[发明专利]一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法有效
| 申请号： | 201310070417.0 | 申请日： | 2013-03-06 |
| 公开（公告）号： | CN103145815A | 公开（公告）日： | 2013-06-12 |
| 发明（设计）人： | 王保民;张亮;曹振;郭素琴;谭桂玉;南铁贵;李召虎 | 申请（专利权）人： | 中国农业大学 |
| 主分类号： | C07K14/325 | 分类号： | C07K14/325;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 关畅 |
| 地址： | 100193 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 抗虫棉 种子 纯化 bt 蛋白 方法 | ||
1.一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法，包括如下步骤：
（1）将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；
（2）将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；
（3）溶解步骤（2）得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；
（4）将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC No.5162分泌产生的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，采用pH10.5、0.01M的CAPS缓冲液提取所述可溶性总蛋白。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，用去离子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液调pH至10.5。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述免疫亲和层析的步骤如下：（1）将所述溶液乙上样于连接有所述抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体的免疫层析柱；（2）用清洗液清洗柱子，去除杂蛋白；（3）用洗脱液进行洗脱，收集过柱后洗脱液，即为含有目的蛋白的溶液。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5的步骤。
6.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5然后进行透析的步骤。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述抗虫棉为转Bt Cry1Ac蛋白的编码基因的棉花；所述Bt毒蛋白为Bt Cry1Ac蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述抗虫棉为国欣棉6号。
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