[发明专利]一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）长薄鳅基因组DNA微卫星序列的获得:

利用生物素四碱基重复探针和长薄鳅基因组酶切片段杂交，然后采用磁珠富集法获取长薄鳅基因组中的四碱基重复单元微卫星片段，经过克隆、阳性鉴定后进行测序，最终筛选出的13对多态性高的微卫星位点，用SSRHunter软件查找四碱基重复次数大于5的微卫星DNA序列；

（2）微卫星引物的设计：

在四碱基重复单元微卫星侧翼，用软件PRIMER3.0设计引物，引物长度为18-25bp，GC含量30-70%，退火温度大于50℃，扩增片段的长度为100-350bp；

（3）微卫星标记标记引物的检测：

对设计的微卫星标记引物进行PCR扩增，反应在MJ-100PCR仪上进行，扩增程序为：94℃预变性2分钟，35个循环，最后72℃延伸10分钟。反应体系为：正反引物各0.2μM，0.2mM dNTP，1×PCR Buffer，1.5-2.5mMMg2+，Taq酶0.5U,10-50ngDNA模板，用蒸馏水补足到总体积到10μl。模板为随机挑选的6个长薄鳅样本。用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，银染观察微卫星条带多态性情况，最后得到13对条带清晰、多态性高的长薄鳅微卫星分子标记。

2.根据权利要求1所述的长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，35个循环的条件为94℃变性40秒,52-65℃退火30秒，72℃延伸40秒。

3.一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的应用，其特征在于，所述13对长薄鳅微卫星分子标记，可以为长薄鳅分子辅助育种提供有力工具，同时有助于长薄鳅遗传学和分子生物学的进一步研究。