[发明专利]一种高效还原偶氮染料的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效还原偶氮染料的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

近年来，随着偶氮染料的广泛使用，其合成及降解过程带来“三致”作用引起的环境污染问题也日渐严重，有关偶氮染料降解的研究也越来越引起人们的重视。自20世纪70年代末发现某些细菌可以还原降解偶氮染料以来，到目前为止已发现多种细菌具有此功能，其中以假单胞菌、芽孢杆菌和肠道杆菌数量最多。细菌对偶氮染料的还原降解主要是通过还原酶催化偶氮键的打开，这是偶氮染料降解的第一步也是最关键的一步，这一类具有催化偶氮键打开使偶氮化合物还原生成芳香胺化合物功能的酶称为偶氮还原酶。

脱色希瓦氏菌Shewanella decolorationis S12是本实验室从广州某印染厂废水处理系统的活性污泥中分离纯化得到的希瓦氏菌新种，可以表达细胞质的非特异性偶氮还原酶进行厌氧偶氮还原。但是S.decolorationis S12的生长受温度影响较为明显，在高温如37℃以上或低温15℃以下，其生长均不理想。因此需要构建一种可以在更广温度范围内实现偶氮染料的脱色的工程菌，其具有更强的脱色活性和长期的存活能力，并可应用于染料废水的处理。

发明内容：

本发明的目的是提供一种可以在更广温度范围内实现偶氮染料的脱色的工程菌，其具有更强的脱色活性和长期的存活能力，并可应用于染料废水的处理的高效还原偶氮染料的基因工程菌及其构建方法和应用。

本发明的高效还原偶氮染料的基因工程菌是通过以下方法构建的，该构建方法包括以下步骤，将NADH-偶氮还原酶基因及其上游启动子序列与表达载体pET-22b(+)连接，然后再转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，而得到具有双启动子的高效还原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR，所述的NADH-偶氮还原酶基因为Genebank登录号为EF198254所示的核苷酸序列，所述的NADH-偶氮还原酶基因上游启动子为Genebank登录号为EF647586所示的核苷酸序列。

本发明的高效还原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR在无乳糖诱导的条件下即可表达一定活性的NADH-偶氮还原酶，在乳糖诱导的条件下可高效表达NADH-偶氮还原酶，其脱色活性远远超过E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)，以及基因供体菌株S.decolorationis S12。

因此本发明的高效还原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR可以应用于偶氮染料的脱色降解。

本发明的选用的质粒表达载体为pET-22b(+)，含有T7启动子和lac操纵子，可以在乳糖诱导下对插入的外源基因进行高效表达。

本发明选用的原核基因表达用的宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，其染色体上整合有λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，控制表达T7噬菌体RNA聚合酶，从而可以识别表达载体上的T7启动子。

本发明提供的高效还原偶氮染料的基因工程菌，可用于环境污染修复领域中的偶氮染料废水的脱色降解。

本发明通过在DNA水平设计含有酶切位点的引物，对S.decolorationis S12基因组中NADH-偶氮还原酶基因（azoR基因，其Genebank登录号为EF198254）的开放阅读框及其上游启动子（其Genebank登录号为EF647586）序列进行PCR扩增，产物经过酶切后与同样经过酶切的表达载体pET-22b(+)连接，并转化大肠杆菌，从而获得高效表达NADH-偶氮还原酶基因（azoR）的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR。该基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR可以在更广温度范围内实现偶氮染料的脱色，具有更强的脱色活性和长期的存活能力，在染料废水处理方面具有更广阔的应用前景。

NADH-偶氮还原酶基因供体菌株S.decolorationis S12已保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏号为CCTCC M203093）和日本东京大学应用微生物研究所（保藏号为IAM15094T），并已获得了国家发明专利（专利号ZL200310112361.7）。

附图说明：

图1为质粒pET-22b(+)的结构示意图；