[发明专利]一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法。

背景技术

1977年Ackermann等首先用Ri质粒转化烟草细胞获得再生植株，开创了植物转基因的历史。此后，有多种技术被发明并应用于植物转基因，主要有农杆菌介导法、基因枪法、原生质体法和花粉管通道法，另外还有病毒介导法、电击法、显微注射法、超声波导入法、吸涨法、花粉携带法、脂质体法、激光微束穿刺法、离子束法等，应用这些方法，已有大量的植物物种被转化成功并产生了转基因植株。这些转化方法，一般是一次将一个目的基因导入植物细胞、并使其稳定整合到植物基因组中。

为了提高农作物的产量或其它农艺性状，常需要将几个基因导入到受体植物中，采用普通转基因方法只能采用分多次、每次转入一个基因的策略，转化效率较低，因此，产生了一些多基因转化方法，一是在构建转化载体时，将多个基因表达框串联到T-DNA区上，该技术构建载体比较繁琐,受Ti质粒容量的限制无法构建包含大于50Kb插入序列的载体；二是将不同外源基因分别构建到不同表达载体上的T-DNA区域,然后将含不同基因的表达载体转入同一农杆菌细胞中，进行多基因转化,但采用这种方法时需要考虑农杆菌容纳多个质粒的能力。此外还可以通过其它策略将多个转基因导入同一植物材料中，例如将含有不同转基因的植物进行杂交，但这些方法不可避免的需要多个植物生长周期才能实现。

很多基因的表达具有组织特异性，某些淀粉合成、谷蛋白合成相关基因仅在禾谷类作物的种子中特异表达，其产物主要催化各种淀粉和谷蛋白的合成，它们构成了胚乳的主要成分，这些基因的组织特异性表达是由其启动子的特异性决定的，如：小麦高分子量谷蛋白（HMW）启动子、大麦D组醇溶蛋白（D-hordin）启动子、大麦B组醇溶蛋白（B-hordin）启动子、水稻谷蛋白（Gt1）启动子、大麦异淀粉酶（Isa）启动子等。

在禾谷类作物的种子中，往往大量积累淀粉，与淀粉合成相关的基因，也在胚乳发育时期特异的大量表达，其中比较重要的关键酶或限速酶基因有：蔗糖合成酶基因（Sh1）；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）大、小亚基，分别由Sh2和Bt2基因编码；颗粒结合型淀粉合成酶（GBSSIIa）基因，决定直链淀粉的合成。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1）或2）：

1）为将腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物；

2）为将筛选标记蛋白基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物。

上述方法中，所述筛选标记蛋白为PPT（它是Bar基因的蛋白表达产物，英文名Phosphinothricin N-acetyltransferase,中译草丁膦N-乙酰转移酶），其氨基酸序列为序列表中序列6；

所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基为Bt2，其氨基酸序列为序列表中序列7；

所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基为Sh2，其氨基酸序列为序列表中序列8；

所述蔗糖合成酶为Sh1，其氨基酸序列为序列表中序列9；

所述颗粒结合型淀粉合成酶为GBSSIIa，其氨基酸序列为序列表中序列10。

所述筛选标记蛋白基因具体为Bar，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2036-2584位核苷酸；

所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因具体为Bt2，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1935-3362位核苷酸；

所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因具体为Sh2，其核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1085-2635位核苷酸；

所述蔗糖合成酶基因具体为Sh1，其核苷酸序列具体为序列表中序列4自5’末端第592-3000位核苷酸；

所述颗粒结合型淀粉合成酶基因具体为GbssIIa，其核苷酸序列具体为序列表中序列5自5’末端第478-2307位核苷酸。