[发明专利]Leber病之线粒体T3866C检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种Leber病之线粒体T3866C检测试剂盒，其特征在于，由置于盒体（8）内的DNA提取混合液（1）、扩增T3866C的PCR混合液（2）、针对T3866C设计的一对外引物（3）、针对T3866C设计的一对内引物（4）、限制性内切酶（5）、阳性对照（6）和阴性对照（7）构成，其中DNA提取混合液（1）由细胞裂解液和溶液Ⅰ组成，扩增T3866C的PCR混合液由脱氧单核苷酸、10×PCR缓冲液、MgCl₂、三蒸水和DNA聚合酶组成，针对T3866C设计的一对外引物有外前向引物F: TACTTCACAAAGCGCCTTCC和外反向引物R: AAGGATTATGGATGCGGTTG，针对T3866C设计的一对内引物有内前向引物F: CAACACAAGAACACCTCTGATTACTCCTGCCAT CATGACCCTTGGCCATAATATGATAGA和内反向引物R: GAGAGTGCGTCATATGTTGTTCCT AGGAAGA，限制性内切酶为限制性内切酶BglⅡ，阳性对照（6）是含有线粒体序列第3866位点发生T>C突变的酶切样本，阴性对照（7）是不含有线粒体序列第3866位点发生T>C突变的酶切样本，溶液Ⅰ的成分是蛋白酶K。

2.根据权利要求1所述的一种Leber病之线粒体T3866C检测试剂盒，其特征在于，在扩增T3866C的PCR混合液（2）中添加0.1-0.2μl二甲基亚砜。

3.根据权利要求1或2所述的一种Leber病之线粒体T3866C检测试剂盒在检测与母系遗传原发性Leber氏病相关的线粒体基因ND1T3866C突变中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA；

（2）特异性PCR扩增：使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件根据SEQ ID NO:5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F_外/R_外、F_内/R_内是能扩增出包含上述原发性Leber氏病的线粒体突变位点的片段，F外/R外扩增出为线粒体DNA的核苷酸3150-4679，其序列为序列表中的SEQ ID NO:1、2；F_内/R_内扩增出为线粒体DNA的核苷酸3806-4058，其序列为序列表中的SEQ ID NO:3、4；

（3）酶切鉴定：将上述PCR产物用限制性内切酶BglⅡ对T3866C突变位点处进行酶切；

（4）突变检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T3866C突变。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述从血标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA，通过以下方法获得：

（1）血标本：取20～200μl血标本或1cm²的血滤纸片放入1.5ml离心管，加入900μl红细胞裂解缓冲液，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.6，室温静置10min，充分裂解红细胞，12000rpm离心1min，收集白细胞沉淀；

（2）带毛囊的毛发：用体积比70%乙醇洗带毛囊的毛发1 次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次，在1.5ml离心管中分别放入2～4 根毛发，毛囊置于离心管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于离心管的部分；

（3）口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必须让被收集者漱口，以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质，半小时内不要喝水、进食、吸烟，然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液，选择如下方法收集唾液样本：①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0.1ml唾液直接吐进EP管内；②生理盐水漱口，吐进离心管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的离心管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次；③用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入离心管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约1cm²碎纸片置于离心管中；

然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，利用盐析法去除杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于-20℃保存备用。