[发明专利]一种用于皮肤组织工程的纳米纤维双层支架制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于皮肤组织工程的纳米纤维双层支架制备方法，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

生物医用材料研究和制备的主要目的是利用各种天然或合成的材料制成人工器官或医疗器械，以替代和修复人体受损的组织器官，最终实现组织器官的正常生理功能。

皮肤作为人体最大的器官，起着保护人体免受外界物体入侵的作用。皮肤的损伤可导致细菌、病原体的入侵，严重者可导致死亡。因此在过去的三十年中，生物医用材料和组织工程领域大量开展了皮肤支架的研究。至今已有多种商品化产品问世，如Integra, Dermagraft等（Priya 等，Tissue Engineering Part B,Reviews,2008;14:105-118）。

人体皮肤为双层结构，由表皮和真皮组成。表皮主要由致密的角化细胞组成，起防护作用；真皮主要由成纤细胞及其分泌的胶原蛋白组成，有较好的弹性和机械强度，在皮肤再生过程中起重要的作用。所以，从仿生的角度看，皮肤支架应为双层结构。商品化的Integra就是由胶原和硅酮制成的双层皮肤替代物（Metcalfe 等, Biomaterials,2007;28:5100-13）；Franco等制备了壳聚糖/明胶水凝胶与聚己内酯/PLGA膜的双层支架（Franco 等, Journal of Materials Science: Materials in Medicine,2011;22:2207-18）； Ma等制备了胶原/壳聚糖的多孔支架与硅酮膜的双层皮肤替代物（Ma 等, Journal of Materials Science: Materials in Medicine,2007;18:2185-91）；中国专利CN101254313公开了一种双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法；美国专利6773723公开了一种胶原/透明质酸的双层皮肤支架。上述双层支架应用于皮肤的修复，取得了良好的效果。但目前文献和公开专利中采用的双层支架多为微米多孔结构，且采用单一的方法制备。最新的组织工程支架研究表明，纳米纤维结构的支架能提供更多的细胞吸附位点，促进细胞的生长（Khang等,Biomaterials,2012;33:5997-6007），因此，纳米纤维的双层支架对于皮肤的修复是一种更好的选择。

发明内容

本发明的主要目的是通过热致相分离和静电纺丝的复合技术，制备聚乳酸/壳聚糖-聚己内酯纳米纤维双层仿生支架。通过优化支架的组成和微观结构，制得生物学性能优良的皮肤组织工程支架，以用于人体皮肤的修复。

本发明的纳米纤维双层支架的制备方法具体如下。

(1) 配制聚乳酸的四氢呋喃溶液，质量浓度在5－10％之间。搅拌均匀后放入预冷的成型模具中。

 (2) 在－18 ℃条件下，将溶液冷冻12小时以上，制得聚乳酸凝胶。在4℃条件下水置换2天，去除四氢呋喃。

 (3) 将水置换后的聚乳酸凝胶再次在－18 ℃条件下冷冻12小时后，在－60 ℃，压力低于30 Pa的条件下冷冻干燥3天，制得纳米纤维聚乳酸支架。

 (4) 配制壳聚糖的三氟乙酸溶液，质量浓度在5－12％之间。配制聚己内酯的三氟乙醇溶液，质量浓度在10－30％之间。

 (5) 将制得的聚乳酸纳米纤维支架用导电双面胶贴在铝箔上，铝箔接地。按一定质量配比均匀混合壳聚糖的三氟乙酸和聚己内酯的三氟乙醇溶液，倒入一个3 ml的针管中，固定针管和基底聚乳酸支架的距离20 cm， 针管通以10－20 kV的高压电，高压静电推动壳聚糖和聚己内酯的混合溶液形成壳聚糖-聚己内酯纳米纤维，贴附在聚乳酸支架的表面，静电纺丝一定时间后制得纳米纤维结构的双层支架。

(6) 制得的双层支架在0.1 mol/L的氨水溶液中浸泡20分钟，去除支架残留的三氟乙酸及三氟乙醇，然后用大量蒸馏水冲洗干净，重新冷冻、冻干，最后经环氧乙烷消毒后可用于细胞培养和组织修复。

本发明制得的三维多孔网络状皮肤支架呈白色，具备纳米纤维的双层结构。其中，表层的壳聚糖-聚己內酯纤维直径约为200 nm，适合角化细胞的生长；底层的聚乳酸纤维直径约在200-750 nm之间，适合成纤细胞的生长。其具体的微观形貌详见说明书附图。

本发明中，所选材料均为生物相容性好的合成或天然聚合物，制备方法简单可行，且制得的双层纳米纤维支架，从结构上仿生人体皮肤的结构，可用做人体皮肤的修复。

附图说明

图1：纳米纤维双层支架微观结构图。

具体实施方式