[发明专利]未触及的活神经元的分离

说明书

技术领域

本发明总体涉及细胞分离领域，具体地涉及分离未触及神经元细胞的方法。

背景技术

神经组织离解后获得的细胞悬浮液包含多种多样的不同细胞类型。但是，特定细胞类型的选择性靶向和分离通常是这些细胞上的实验性体外研究的先决条件。相对容易的技术如活细胞通过培养条件的密度梯度离心或分离导致低纯度和大量细胞损失。

神经生物学领域所广泛使用的方法为在细胞类型特异性启动子控制下表达荧光蛋白质的转基因小鼠和促进特定细胞群分离的荧光激活细胞分选的联合使用(Nolte等，2001：Glia 33：72-86；Tomomura等，2001：Eur J Neurosci 14：57-63；Tamamaki等，2003：J Comp Neurol 467，60-79；Zuo等，2004：J Neurosci 24：10999-11009)。

但是，除需要转基因小鼠和昂贵设备之外，该过程非常麻烦并耗时。对于非转基因动物，也描述了在用神经元特异性标记物NeuN标记细胞之后神经元的荧光激活细胞分选(Guez-Barber等，012：J Neurosci Methods 203，10-18)。然而，该方法不允许分离活神经元，因为其需要标记细胞内标记物。

导致神经元细胞分离的另一种技术由Barres等描述(1988：Neuron 1：791-803)。该称为免疫抗体包被筛选(immunopanning)的方法使用抗体介导的细胞粘附。最初描述的是使用Thy-1作为视网膜神经节细胞的特异性标记物来分离视网膜细胞，该方法也通过随后少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的贫化而用于分离神经元(Cahoy等，2008：J Neurosci 28：264-278)。但是，至今未描述使用该技术一步分离神经元。

一种用于分离期望细胞类型的简单方法为细胞的磁性分离，例如磁 性激活细胞分选(MACS技术，Miltenyi Biotec GmbH，德国；US5411863、US5543289、US6020210、US6417011)。该技术需要允许通过连接至磁性微珠的抗体直接分离目标细胞的标记物。然而，迄今未知通用的神经元特异性细胞表面标记物，因此活神经元的直接磁性细胞分选是不可行的。然而，可应用负性分离策略来分离不能直接处理的细胞群。在该方法中，非靶细胞被磁性标记并贫化，从而分离未标记的目标细胞。

本发明的目的是提供一种改进的用于从衍生自神经组织的细胞悬浮液中分离活神经元细胞并去除非神经元细胞的方法。

发明概述

发明人令人惊讶地将CD51(整合素αV(IntegrinαV))鉴定为由大多数非神经元细胞表达的标记物，所述非神经元细胞存在于由神经组织例如星形胶质细胞、星形胶质细胞前体、小胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞前体、内皮细胞、成纤维细胞、和淋巴细胞获得的细胞悬浮液中。此外，发明人也将CD51鉴定为通过大多数存在于自然分化的多能细胞中的非神经元细胞表达的标记物。因此，该标记物可用作用于贫化非神经元细胞的泛非神经元细胞表面标记物。

CD51代表整合素α链V(UniProtKB acc.no.P43406(小鼠)、P06756(人))。其与包括β1(CD29)、β3(CD61)、β5和β6的整合素家族的β亚单位非共价连接以形成功能信号复合物。整合素αV在发育期间和在成人中通过多种组织表达。其在血管发生、血管生成、伤口愈合、肿瘤发生、神经形成、和炎症中扮演至关重要的角色(Takada等，2007：Genome Biology 8：215.1-215.9)。CD51也被报道通过成纤维细胞表达(Treese等，2008：Cytometry A 73A：351-360)和通过骨骼肌细胞表达(Hirsch等，1994：Dev Dyn 201：108-120)。在脑中，发现其对于大脑皮层中神经元迁移期间的神经元-神经胶质胶粘相互作用是至关重要的(Anton等，1999：Neuron 22：277-289)。

本发明提供抗原CD51作为神经元细胞的负性选择标记物的用途。

一种用于富集、分离和/或检测活神经元细胞的方法，包括步骤a)使包含神经元细胞的样品与连接至固相的对CD51抗原特异性的抗原结 合片段例如抗体或抗体片段接触，从而标记所述样品的CD51阳性细胞，和b)分离所述样品的非标记细胞，即未被对CD51抗原特异性的抗原结合片段结合的细胞。这些为未触及的靶细胞，即基本上不含非神经元细胞的富集神经元细胞。