[发明专利]一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的提取方法，具体涉及一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗是全球最重要的糖料作物和能源作物，蔗糖和甘蔗乙醇分别占世界食糖的77%和生物质乙醇的42%。在我国，蔗糖占食糖总量的92%。蔗糖是大宗农产品，关系到国计民生，建国以来，我国食糖基本处于供不应求的状态。目前，我国食糖人均为10公斤，仅为世界平均水平的一半。近年来，由于食品结构变化和食品工业的发展，食糖供需缺口逐渐加大，2012年我国进口食糖比2011年增加28%。我国甘蔗立地条件差，80%以上为坡地或旱坡地。干旱是制约我国甘蔗产业发展的主要因素之一，每年因干旱造成的甘蔗减产高达20-30%。甘蔗病虫害频发，黑穗病、花叶病、黄叶病、宿根矮化病等，每年造成大量的损失；在甘蔗虫害中，甘蔗螟虫危害最大，部分重灾区螟害节率高达60%。近年来，劳动力成本激增，甘蔗机械化已经迫在眉睫，而现有品种却不适应机械化作业。如何在有限的耕地和立地条件下，培育高产、高糖、抗旱、宿根型好、适于机械化采收的甘蔗品种，是我国甘蔗育种面临的主要问题。要攻克这些问题，必须了解甘蔗碳代谢机制，如光合作用、蔗糖积累调控、抗逆机制等。甘蔗是高度杂合的多倍体或非整倍体，是迄今人类驯化作物中基因组最为复杂的作物。甘蔗染色体遗传行为怪异，F1代和BC1代大多以2n+n的方式遗传，BC2则一般为n+n，因此甘蔗的遗传育种研究远落后于其他作物。双向电泳技术是在蛋白质水平上研究基因表达的最有效方法之一，是研究甘蔗碳代谢、逆境应答等生物学过程和机理的重要手段。蛋白质样品的制备是双向电泳的关键步骤，直接关系到双向电泳蛋白分离的效率、可靠性和重演性。

 2008年郭晋龙等人以甘蔗品种福农95-1702为供试材料提取叶片总蛋白，按鲜重的10％加入PVP，研成粉状后，再加人10倍体积的-20℃预冷丙酮（含体积比10％TCA和体积比0.07％的β-巯基乙醇）。涡旋后静置于-20℃，沉降过夜；随后在4℃，30000 g离心20 min，弃上清液。重悬沉淀于含0.07％的β-巯基乙醇的等体积冰预冷丙酮溶液里1-2次；4℃，30000 g，离心20 min后真空干燥沉淀。裂解后用24 cm，线性pH4-7胶条对所提蛋白进行双向电泳分离，经考马斯亮蓝染色后得到约800个点。2011年张燕、何文锦等人以甘蔗品种福农28为供试材料提取叶片总蛋白，将叶片研磨成粉末后加到含有100 mmol/L Tris、50 mmol/ L抗坏血酸、100 mmol/ L氯化钾、50 mmol/ L硼砂、体积比1%的TritonX-100、体积比2%的β-巯基乙醇的酚抽液中，漩涡，离心。取上层加入到0.1 mol/L乙酸铵甲醇溶液中-20 ℃过夜，之后用甲醇洗涤一次再用丙酮（含体积分数2%的β-巯基乙醇）洗涤2次，真空烘干沉淀。裂解后用24 cm，线性pH4-7胶条对所提蛋白进行双向电泳分离，经考马斯亮蓝染色得到约1000个点。但是甘蔗叶片中含有酚、醌、色素等一些次生代谢产物，导致双向电泳本底较高，影响分析结果。应用文献报道的方法提取甘蔗蛋白繁琐或不能很有效的去除干扰物质，本发明在此基础上，对蛋白提取配方及方法进行了优化，增加了超声波处理，对细胞进行了有效破碎；有效去除了干扰物质，从而建立了一种适合双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，是一种以甘蔗正一叶为原料提取甘蔗蛋白质的方法。本方法流程简单，提取效率高，为蛋白质组学研究后续工作提供良好的基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明的一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）取甘蔗正一叶位的新鲜叶片，清洗干净后剪碎，秤取2.0 g，置于盛有液氮的研钵中，加入0.2 g PVP，研磨成粉末；

（2）将粉末全部转入50 mL离心管中，加入4 ℃预冷的提取缓冲液5 mL，使用时加入0.2 mL β-巯基乙醇；所述提取缓冲液配制方法为：取蔗糖150 g，SDS 7.5 g，用pH8.8的Tris-HCl 缓冲液定容至500 mL； pH8.8的Tris-HCl缓冲液的配制方法为：取181.5 g Tris溶于800 mL水中，用4N的HCl调节pH至8.8，用水定容至1000 mL；

 （3）漩涡振荡5 min后，冰浴条件下重复超声2次，每次超声5-10 min，期间摇匀，超声强度为0.4 -0.6  w/cm²；