[发明专利]雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法

权利要求书

1.一种雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：以野生两年雷公藤幼苗经室温二次栽培以后的新生根系为外植体，在MS培养基上培养愈伤组织，培养条件为：光照强度为1500lx-2500lx，温度25±1℃，18-25天形成愈伤组织；

步骤二：将成熟质地疏松的愈伤组织投入6，7-V培养基中，接种量为5g，置于转速为120r/min摇床上，振荡培养18天，18天继代一次，连续继代5-8代，即得雷公藤悬浮细胞液；

步骤三：调节所述雷公藤悬浮细胞液的pH至5.0，按照每200ml，10g的接种量，加入诱导子，在25℃、振荡速度为120r/min的摇瓶振荡培养18天；此后每隔3天检测反应体系的pH值使pH保持在5.0，当反应体系中的雷公藤甲素及其衍生物的总含量低于0.0001mg/L后，停止震荡培养，过滤除菌后取上清液，将上清液于8000r/min，离心10min去除沉淀；

步骤四：将经过步骤三处理所得的上清液与等体积石油醚充分混合，于分液漏斗中静置至分层，弃去石油醚层，再用相对于所述上清液1/2体积的乙酸乙酯萃取3次，过中性氧化铝层析柱脱去色素，再用体积比为4∶1的石油醚-乙酸乙酯20ml淋洗，然后用体积比为4∶1的石油醚-乙酸乙酯60ml冲洗柱子，收集洗脱液；用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干，加3ml色谱纯甲醇溶解，过0.22μm微孔滤膜，即得产品。

2.如权利要求1所述的雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤一和步骤二之间还包括下述步骤：

将所述愈伤组织作为初始材料，每20天继代一次，经过10-20代继代即可获得质地疏松的成熟愈伤组织；其中，继代培养基为：MS培养基、2，4-二氯苯氧乙酸0.6mg/L、萘乙酸0.6mg/L、6-糖基氨基嘌呤1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂3.5g/L。

3.如权利要求1所述的雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的雷公藤甲素及其衍生物的总含量采用HPLC检测，HPLC检测条件为：色谱柱Hypersil ODS2-C18250mm、吸收波长：218nm、流动相∶乙腈∶水(30∶70)、流速：1ml/min、柱稳：25℃、进样量：20μl。

4.如权利要求1所述的雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的诱导子为下述物质中任意两种及两种以上组合：

α-环糊精、β-环糊精、2，6-二甲基-β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、甲基化-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精，葡萄糖-β-环糊精，磺丁基-β-环糊精、γ-环状糊精、羧甲基-β-环糊精、酵母抽提物、绿色木霉、大豆褐杆病菌、黄萎病原菌、蜡、样芽胞杆菌、腐霉菌、灭蚊真菌、黑曲霉、根腐霉诱导子、大豆褐杆病菌、根癌农杆坂崎肠杆菌、白腐霉浆、立枯丝核菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌诱导菌、美丽镰刀菌培养液、绿色木霉、大豆褐杆病菌、隐地疫霉、菜豆炭疽病、灵芝、孔球孢、蓝藻、无根根霉、真菌诱导子；茉莉酸甲酯、水杨酸、壳聚糖、茉莉酸、真菌聚糖类、β-葡聚糖、谷胱甘肽、2-羟乙基茉莉、油菜素内酯、云酯、甲壳素、硫酸铜、氯化镉、Ag+、Al³⁺、Co²⁺、Va²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、乙烯、280-315nm的UV照射。