[发明专利]抗CD20单克隆抗体可变区序列及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及抗CD20单克隆抗体可变区序列及其制备方法。

背景技术

CD20分子是人类B淋巴细胞表面特有的标识，在B淋巴细胞表面以寡聚体形式存在。CD20的结构与一些离子通道相似，每一个CD20单体都是4次跨膜，分子的N端和C端在细胞质的同侧，可形成多聚体，CD20可在B淋巴细胞膜上形成钙离子通道，CD20抗体在BCR的作用下，可形成钙离子流。B细胞活化后，BCR—CD20复合物解离，磷蛋白、钙调素结合蛋白会暂时被招募到CD20，从而参与胞内信号的传导。

在人体中几乎所有正常或恶性B淋巴细胞都存在CD20抗原。但是，其他血细胞如T淋巴细胞、NK细胞及粒细胞等不存在CD20抗原。因此，CD20抗原是单克隆抗体治疗的一个理想的靶抗原。现在已经合成了一种针对CD20抗原的特异性抗体，称为抗CD20，用于治疗病情缓慢、侵袭性低的B细胞非霍奇金淋巴瘤，有效率达30％-50％。

人体对鼠源抗体具有免疫反应，这也是鼠源抗体应用于临床治疗的主要障碍。通过基因工程抗体技术可以在基因水平上改造抗体，降低鼠源抗体的免疫原性，提高抗体特异性、稳定性和亲和力。对鼠源抗体进行人源化改造，可保留抗体可变区与人源抗体恒定区融合，提高抗体亲和力；或改造抗体结构，构建只保留抗体可变区的scFv或含抗体可变区和部分恒定区的Fab,可提高抗体在体内的吸收百分比和半衰期。

发明内容

如上所述，抗CD20应用于B淋巴细胞瘤的临床治疗，疗效显著，毒副作用小，如今对抗CD20的分析研究越来越多，基于这一背景，本发明的目的是构建抗CD20单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列，同上提供制备上述核苷酸序列的方法。

为实现上述目的，本发明用CD20蛋白作为抗原来免疫小鼠，然后检测出相应抗体表达呈阳性的小鼠，取表达呈阳性小鼠的脾脏，分离脾细胞，然后融合脾细胞和骨髓瘤细胞，得到杂交瘤细胞；在HAT培养基中培养后，检测得到抗体表达阳性克隆，提取阳性杂交瘤细胞总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到相应抗体基因的cDNA，再通过PCR扩增获得相应抗体重链可变区和轻链可变区，由此实现本发明。

本发明提供了下述各项：

抗CD20单克隆抗体可变区序列，包含两种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为51802-VH和51802-VL。

优选的，所述核苷酸序列51802-VH和51802-VL由保藏号为407CT20.1.2的杂交瘤细胞株制备而成。

优选的，所述51802-VH编码117个氨基酸，分子量为13273D，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为26aa-33aa,51aa-60aa和99aa-106aa。

优选的，所述51802-VL编码113个氨基酸，分子量为12297D，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为27aa-37aa,55aa-57aa和94aa-102aa。

优选的，还包括与上述两种核苷酸序列具有相同氨基酸序列产物的核苷酸序列。

优选的，还包括经过一个或者几个碱基替换、缺失或添加后仍具有与所述核苷酸序列产生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。

制备抗CD20单克隆抗体可变区序列的方法，包括以下步骤：

（1）杂交瘤细胞的制备：首先用CD20蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑选出免疫后抗体表达呈阳性的小鼠，取其脾脏细胞，然后将分离的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；

（2）单克隆细胞的筛选：将上述杂交瘤细胞在HAT培养基中培养，对ELISA检测呈阳性的单克隆细胞进行ELISA复筛，然后将筛选出的ELISA阳性单克隆细胞进行WB复筛，再将WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆细胞扩大培养后定株、冻存；

（3）杂交瘤细胞抗CD20单克隆抗体的获得：首先鉴定步骤（2）所制备的单克隆细胞的亚类亚型，然后将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，再将产生的腹水通过层析纯化后得到抗CD20单克隆抗体；

（4）抗CD20单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆：提取步骤（3）中所用的单克隆细胞的总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到cDNA，最后克隆得到抗CD20单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。