[发明专利]一种携带PTD的抗人CD3单链抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种携带PTD的抗人CD3单链抗体的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

CD3是Ｔ淋巴细胞的一种分化抗原，由γ、δ、ε、Ｐ₂₈ 4条多肽链组成的多聚体，它与Ｔ细胞抗原受体(TCR)一起构成TCR—CD3复合物，在Ｔ细胞识别抗原及活化过程中起重要作用。80年初,美国Ortho公司运用淋巴细胞杂交瘤技术，研制出人淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体(anti-CD3 Monclonalantibody, anti-CD3McAb)，由于其许多的独特免疫调节活性引起人们的极大兴趣。对鼠源性抗体的改造、完全人源化抗体的制备、筛选高亲和性的突变抗体以及与其它生物活性物质交联形成双功能结构等均成为现实，甚至不需要通过动物免疫即可获得抗体分子基因，使基因工程抗体的研究在诊断、治疗、生物导向等领域的应用广泛而深入，并取得了一些令人振奋的结果。

蛋白转导结构域（PTD）是人类免疫缺陷病毒（HIV）-1所编码的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段，具有独特的跨膜转运方式，其特点是转导速度快，效率高。PTD能将多肽、寡核苷酸、抗体、酶等多种的生物大分子在短期内导入100%的靶细胞。如果将特殊功能的肽段-PTD的基因与抗CD3抗体基因重链和轻链的可变区基因选择性融合，可得到携带PTD抗CD3单链抗体基因，使CD3进入更快穿透细胞，发挥其生物功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用高效疏水相互作用色谱法一步实现携带PTD抗人CD3单链抗体(PTD-CD3)复性与纯化的制备方法。

本发明实现过程如下：

一种携带PTD的抗人CD3单链抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）天然抗CD3抗体基因与肽段-PTD基因融合得到携带PTD抗CD3单链抗体基因，将携带PTD抗CD3单链抗体基因插入E.coli表达载体pBV220表达，获得携带PTD的抗人CD3单链抗体（PTD-CD3）重组菌；

（2）PTD-CD3单链抗体重组菌在E.coli中的表达产物为含PTD-CD3的包涵体，将包涵体溶解于6.0～8.0 mol/L脲溶液，使用结构式（I）或（II）所示的高效疏水色谱介质进行复性与纯化，收集色谱馏分，得到复性与纯化的PTD-CD3；

 （I）

其中n=10～25

  （II）    

空白基质为孔径为20-30 nm；粒径为5-10μm的大孔硅胶微球；

色谱条件：流动相A液为2～3 mol/L (NH₄)₂SO₄，20～50 mmol/L KH₂PO₄，pH 7～8；流动相B液为20～50 mmol/L KH₂PO₄，pH 7～8；流速为1.0～5.0 mL/min；采用0-100% B液线性梯度洗脱；检测波长280 nm；

（3）将PTD-CD3单链抗体用体积排阻色谱进一步纯化，体积排阻色谱介质为Superdex75R。

上述步骤（1）中，肽段-PTD序列为GRKKRRQRRRPPQ,获得的PTD-CD3单链抗体重组菌为pBV220/PTD-CD3/DH5α。

上述步骤（2）中，含PTD-CD3的包涵体用强变性剂6.0～8.0 mol/L脲溶解，放置12 h以上分离，得到含PTD-CD3包涵体变性抽提液。

上述步骤（2）中，结构式（I）所示的高效疏水相互作用色谱固定相中n等于20。

上述步骤（2）中，高效疏水相互作用色谱柱分别为10×20 mm I.D.饼型分析型或10×50 mm I.D.半制备色谱柱，自行装填色谱柱的压力大于 40 MPa。所述10×20 mm I.D.饼型分析型或10×50 mm I.D.半制备色谱柱参考专利方法制备（ZL9210272.3，US 7,208,085 B2，EP1 396 721 B1）。