[发明专利]微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法

权利要求书

1.一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）试剂配制：配制Mueller Hinton Broth培养基；

2）细菌悬液制备：培养细菌至对数生长期，制备细菌悬液；

3）细菌悬液计数：倍比稀释所述的步骤2）中的细菌悬液后滴板计数；

4）阳离子抗菌肽稀释：倍比稀释阳离子抗菌肽至不同测试浓度梯度；

5）测定最小抑菌浓度：将所述的步骤4）中的不同测试浓度梯度的阳离子抗菌肽与步骤2）中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀，无肉眼可见细菌沉淀的孔对应的最小浓度即为最小抑菌浓度；

6）测定最小杀菌浓度：将所述的步骤5）中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长无菌落生长扇区对应的最小浓度即为最小杀菌浓度。

2.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤1）中的试剂配制过程如下：

1.1) MHB培养基：21 g MHB培养基粉末溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，室温冷却，4 ℃保存备用;

1.2) MHB琼脂培养基：21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4℃保存备用;

1.3)药剂储存液：准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml，4 ℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤2）中细菌悬液制备过程如下：

2.1)选取-80 ℃保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 ℃培养12 hr，待长出单菌落后，4 ℃保存备用；

2.2)用接种环挑取步骤2.1)中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 ℃保存备用；

2.3)混悬步骤2.2)中的菌液，移取50 μl接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养约2 hr；

2.4)测定步骤2.3)中菌液的OD600值，OD600值约为0.5时可使用，0.6<OD600<1.0时，可用MHB培养基稀释至适宜范围；

2.5)将步骤2.4)中的菌液与MHB培养基以30 μl:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。

4.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤3）中细菌悬液计数过程如下：

3.1）所述的2.5)中的细菌悬液与MHB培养基以10 μl:90 μl混合稀释，连续4次，分别得到10、10^2、10^3和10^4倍稀释细菌悬液；

3.2）取1块MHB琼脂培养基，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区，从步骤3.1）中的10、10^2、10^3和10^4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μl滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复；

3.3）待步骤3.2）中的细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr，选取3个重复菌落总数为30~200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30×稀释倍数×1000，CFU值在0.5~1×10^6/ml为宜。

5.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤4）中药剂稀释过程如下：

  取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第1列每孔加入32 μl步骤1.3)中的药剂储存液和168 μl无菌水，终浓度为640 μg/ml；第2~10列每孔加入100 μl 无菌水；从第1列起移取100 μl加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100 μl；得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10个浓度梯度，每孔100 μl，现用现配。