[发明专利]重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp、家蚕杆状重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及到利用杆状病毒重组系统在家蚕细胞及家蚕体内融合表达大肠杆菌天冬酰胺酶的方法。

背景技术

L-天冬酰胺酶Ⅱ( L-AsparaginaseⅡ , EC 3.5.1.1) 即L-天酰胺酰胺基水解酶, 能够专一性地催化L-天冬酞胺水解生成L-天冬氨酸和氨，是一种重要的蛋白类抗肿瘤药物。在临床上主要广泛用于淋巴瘤和儿童急性淋巴细胞白血病(ALL )的治疗, 还可用于黑素肉瘤、霍金森病、胰腺癌等疾病的治疗。

目前, L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产大多采用以大肠杆菌为宿主的基因工程菌,在生产上存在着发酵水平低和分离纯化步骤繁多两方面问题。

专利号为201110027008.3的中国发明专利，公开了一种重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法。该方法首次实现了以家蚕为宿主进行L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产。该方法不仅提高了生产效率、简化了纯化程序、提高了纯化水平，而且由于蚕体中有天然的蛋白质保护剂，对表达产物具有保护作用。该方法是本单位的研究成果，发明人不满足于现状，在该技术领域继续做了深入研究，进一步提高L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性，进一步简化了L-天冬酰胺酶Ⅱ的纯化。

发明内容

本发明的目的是为了提高L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性，为了简化L-天冬酰胺酶Ⅱ的纯化，提供一种重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp。利用该质粒可以制取家蚕杆状重组病毒，而该家蚕杆状重组病毒则能够高效地生产L-天冬酰胺酶Ⅱ，并且通过该方法制备的L-天冬酰胺酶Ⅱ具有活性高，纯化简单的优点。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp，其特征在于它是通过以下方法制备的：

（1）以家蚕杆状病毒DNA为模板，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得扩增产物da26；以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得扩增产物Asp；

（2）扩增产物da26及Asp琼脂糖凝胶电泳，回收纯化后用XbaⅠ做单酶切，然后将da26、asp酶切产物纯化并连接，得到da26-Asp连接产物；

（3）以da26-Asp连接产物为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.4分别为上游引物进行PCR扩增，得扩增产物da26-Asp；

（4）扩增产物da26-Asp与质粒pMD??18-T做连接，得到重组质粒pMD??18-T-da26-Asp；

（5）以BmNPV DNA为模板，SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为上下游引物，通过扩增BmNPV 多角体基因的读码框，扩增的片段用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，克隆至杆状病毒的p-polh、p-10双启动子转移载体pFastdual质粒的多角体启动子p-polh下，得到重组质粒pFastdual-polh；

（6）测序正确的重组质粒pMD??18-T-da26-Asp 以SmaⅠ和SphⅠ双酶切，克隆至重组质粒pFastdual-polh的p-p10启动子下，得到重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp；

各引物序列如下：

SEQ ID No.1：TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCACACG；

SEQ ID No.2：GCTCTAGAGCAATAGGCGTTAATATCACTTTG；

SEQ ID No.3：GCTCTAGAGCCCATCACCATCACCATCAC；

SEQ ID No.4：ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT；

SEQ ID No.5：GCGGATCC ATGCCGAATT ATTCATACA；