[发明专利]无固定点靶物质的适配体筛选方法

权利要求书

1.一种无固定点靶物质的适配体筛选方法，其特征在于，通过构建随机寡核苷酸文库以及用于PCR扩增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文库引物，并利用链霉亲和素标记的琼脂糖颗粒固定寡核苷酸文库，最终通过SELEX方法筛选得到可用于克隆测序的PCR产物，经测序后得到与无固定点靶物质特异亲和性结合的适配体；

所述的随机寡核苷酸文库的序列为：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’，其中：两端分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的19bp的固定序列，中间30个碱基为随机序列；

所述的上游引物，即P1序列，如Seq ID No.1所示；

所述的下游引物，即P2序列，如Seq ID No.3所示；

所述的固定寡核苷酸文库引物，即P3序列，为5’-Biotin-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’其中：P3序列由Biotin和Seq ID No.3所示的下游引物序列组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的固定寡核苷酸文库是指：将含有随机寡核苷酸文库与含有固定寡核苷酸文库引物的水溶液混合后进行退火处理，然后将将退火后的混合液加入到装有表面接枝亲和素的琼脂糖的柱子中，通过生物素-亲和素作用将随机寡核苷酸库固定在琼脂糖颗粒上。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的混合是指：以摩尔比为1:2～3的比例混合。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的退火处理是指：在94°C环境下变性60s；然后在59°C环境下退火60min；再在25°C环境下延伸5min，其中：退火过程及延伸过程的降温速度为0.1°C/s。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的固定寡核苷酸文库在SELEX方法筛选前经缓冲液充分洗涤，离心除去未固定的寡核苷酸和P3序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的SELEX方法是指：依次进行若干轮的正向SELEX筛选和反向SELEX筛选。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的正向SELEX筛选是指：向固定有随机寡核苷酸库的琼脂糖颗粒加入无固定点靶物质，经孵育后离心处理并收集离心液，作为非对称PCR扩增的模板，经PCR程序扩增后收集产物并纯化，作为后续正向筛选用文库，使得无固定点靶物质浓度降低。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征是，所述的正向SELEX筛选的次数为以无固定点靶物质浓度降低至标准检出限以下时终止，并进行反向SELEX筛选。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的反向SELEX筛选是指：当靶物质为某种重金属离子，则向固定有随机寡核苷酸库的琼脂糖颗粒先加入与无固定点靶物质性质或结构类似的不同的重金属离子，孵育后离心处理并去除离心液，然后加入无固定点靶物质，孵育后离心处理并收集离心液，作为PCR扩增寡核苷酸的模板，经PCR程序扩增后收集产物并纯化，作为后续反向筛选的文库。

10.根据权利要求6或9所述的方法，其特征是，所述的反向SELEX筛选的次数为3～5次。