[发明专利]一种脂肪干细胞-生物材料复合物冻存液及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及脂肪干细胞-脱钙骨复合物冻存液和脂肪干细胞-脱钙骨复合物的处理方法。

背景技术

传统深低温冻存要求精确的降温速率控制，操作复杂，但仍无法避免在降温过程中出现冰晶对细胞造成伤害。玻璃化冻存方法很好地解决了这个问题。在玻璃化过程中，物质并不结晶，而是形成一种超冷冻液体，外观接近固体，但仍保持着作为液体特征的分子无序性。细胞或组织在玻璃化过程中受到的损伤降到了最小。

脂肪来源干细胞有较强的增殖及成骨能力，且采集时对病人造成的创伤较小，临床应用潜能较大。组织工程骨构建技术与玻璃化冻存的结合为临床应用提供了更大的便利性和更多的选择性。

因此本领域迫切需要提供简便而有效地冻存以脂肪来源干细胞为种子细胞的种子细胞-生物材料复合物的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的冻存液。

本发明的另一个目的是提供一种如上述的脂肪干细胞-脱钙骨复合物的冻存液的用途。

本发明的再一个目的是提供一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的处理方法。

在本发明的第一方面，提供了一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物冻存液，所述的冻存液中含有：0.2-0.8mol/L海藻糖；和10-40m/v%促红细胞生成素。

在另一优选例中，所述的冻存液中含有：0.4-0.8mol/L海藻糖；和20-38m/v%促红细胞生成素。

更佳地，所述的冻存液中含有：0.6-0.8mol/L海藻糖；和25-35m/v%促红细胞生成素。

在另一优选例中，所述冻存液含有余量的无血清DMEM培养液。

最佳地，所述冻存液含有0.8mol/L海藻糖，30m/v%促红细胞生成素和余量的无血清DMEM培养液。

在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的冻存液的用途，所述的冻存液可用于保存脂肪干细胞-脱钙骨复合物。

在本发明的第三方面，提供了一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的处理方法，所述的方法包括步骤：

（1）将脂肪干细胞接种脱钙骨，使用成骨诱导液诱导培养；

（2）将步骤（1）得到的脂肪干细胞-脱钙骨复合物和如上所述的本发明提供的冻存液混合；和

（3）将与冻存液混合的脂肪干细胞-脱钙骨复合物在液氮中冻存，得到冷冻保存的脂肪干细胞-脱钙骨复合物。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

（4）将冷冻保存的脂肪干细胞-脱钙骨复合物在40－80℃水浴复温。

更佳地，复温3－8天，最佳地为4－6天。

据此，本发明提供了简便而有效地冻存以脂肪来源干细胞为种子细胞的种子细胞-生物材料复合物的方法。

附图说明

图1显示了不同组分冻存液冻存后细胞存活率变化。

图2显示了不同组分冻存液冻存后碱性磷酸酶活性变化。

图3显示了不同组分冻存液冻存后骨钙素分泌变化。

图4显示了Design-expert（软件名称，用于实验设计，为本领域并不限于本领域的公认顶级实验设计软件，美国Stat-Ease,Inc公司产品）运行多响应优化结果，即分类因素水平的16个组合的结果。

图5显示了复苏后细胞生长曲线。

图6显示了复苏后碱性磷酸酶活性。

图7显示了冻存与未冻存的细胞-支架复合物对骨修复效果相同。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了一种脂肪干细胞-脱钙骨复合物的冷冻保存液，它可以长久而有效地保持脂肪干细胞-脱钙骨复合物中脂肪干细胞的存活率、及其细胞功能。另外，发明人针对多个优化目标，采用期望函数（The desirability function）的多响应优化方法，将每个响应转换成期望函数，并求得期望函数的几何平均值即为最终的响应目标。

具体地，发明人发现可以将脂肪干细胞-脱钙骨复合物和含有海藻糖和促红细胞生成素的溶液混合后，进行冻存。

如本文所用，“促红细胞生成素(erythropoietin;erythrogenin;EPO)”是指在哺乳动物肾脏和肝脏产生的一种分子质量为46kDa的糖蛋白细胞因子；能刺激幼稚红细胞的增生，血红蛋白化和红细胞的成熟。

如本文所用，“脂肪干细胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)”是指从脂肪组织中得到的具有增殖分化能力的干细胞。更佳地，指同时具有多向分化能力的脂肪干细胞。