[发明专利]一种大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法

说明书

技术领域

本发明属于植物品种鉴定和种子纯度检验技术领域，尤其涉及一种利用种子蛋白质超薄等电聚焦电泳技术进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法。 

背景技术

真实性和品种纯度鉴定是种子生产工作中不可缺少的重要步骤，是保证良种优良遗传性充分发挥，促进农业生产持续稳产、高产的有效措施；是防止良种混杂退化，提高种子质量和产品品质的必要手段；是克服盲目引种、调种，避免品种混淆和差错的重要环节；是正确评定种子等级、贯彻优种优价政策的主要依据。总之品种纯度检验对种子工作和农业生产起了巨大的推动和保证作用。 

在生产实践中，由于忽视种子真实性和品种纯度的鉴定，往往给农业生产带来不可弥补的损失。如杂交稻生产中，错把不育系当杂交种播种，造成颗粒无收；安徽岳西错把华联2号当汕优63引进种植造成几公顷良田绝收。 

由于品种混杂、品种纯度降低会明显降低作物产量和品质。早熟品种混杂迟熟品种，就会因迟熟品种不能充分成熟而影响了作物产量；抗病品种中混杂不抗病品种的种子，会降低播种品质和田间植株抗病能力；高蛋白品种混有低蛋白品种种子，就会降低其主要的品质。另一方面品种纯度不高的种子播入田间后会导致作物生长发育不一致，植株高矮不一，成熟迟早不相同，对田间管理和机械作业带来很大困难。纯度降低越多，影响产量的幅度也越大。据测杂交稻繁殖田亲本(PO)纯度每下降1％制种田(F1)纯度就会下降6％～7％，而大田产量(商品粮)则下降10％左右。杂交油菜秦油2号由于不育系Ac易受温度影响常产生自交结实，致使不育株增加，杂种纯度下降，导致大田生产大幅度 减产。 

由此可见，在种子生产的各环节如调种、引种、检验、种子收购和经营过程都应重视品种纯度鉴定，并建立必要的鉴定制度，确保农业种子的品种质量。 

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种利用种子蛋白质超薄等电聚焦电泳进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法。 

本发明实施例是这样实现的，一种利用种子蛋白质超薄等电聚焦电泳技术进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，所述大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法包括以下步骤： 

蛋白质提取：取单粒种子，逐粒粉碎，置于离心管中，提取蛋白质； 

制备凝胶； 

进行电泳分析； 

经固定后的电泳胶片在考马斯亮蓝溶液中染色； 

染色后的凝胶放在脱色液中脱色； 

脱色晾干后的胶片经扫描仪扫描，得出电泳图谱； 

进行准确性比较。 

进一步，蛋白质提取方法为：取单粒种子，逐粒粉碎，置于离心管中；大白菜每粒种子加入60μL去离子水，室温下提取1h；提取1h后，将离心管放在旋涡混合器上混匀约1min，然后放入冷冻离心机中10000rpm离心10min； 

进一步，制备凝胶方法为：(1)称取0.08g牛磺酸、0.8g尿素于小烧杯中；(2)加入5ml凝胶贮液吹打溶解；(3)加入220μL pH范围为5-8的两性电解质；(4)加入30μL20％过硫酸铵溶液；(5)4μL TEMED；(6)混合后将所有溶液，加到胶片上，盖上玻璃盖；将一片124×258mm Gel-Fix聚酯胶片(Serva)展开放在玻璃板上，为使胶片与玻璃板紧密贴合，可在玻璃板上先滴一些清水，铺上胶片并用滚筒赶走气泡；然后将配好的凝胶溶液约6.5ml倒 在胶片中央。将经硅烷化试剂(Repel-Silane ES)处理过的上盖玻璃板放到聚酯胶片上，然后缓慢放下，使凝胶分布在上下玻璃板之间的空隙中。上盖玻璃板长方形的两个长边上均贴有厚度为0.12mm的电工胶布以作为上下玻璃板之间的间隔，因而所制出的聚丙烯酰胺凝胶厚度即为0.12mm。室温下放置约45min后，凝胶聚合完成。 

进一步，电泳分析方法为：(1)摆放好电极条和点样带；(2)用移液器吸取蛋白质提取液20μL，点于点样带的小孔中；(3)点完样后，在电极滤纸上放上电极，并用一块玻璃板压住，以确保电极与电极纸条接触紧密。聚焦时，温度设定为10℃，电压在90min内由120V上升至600V，90min后，聚焦完成；(4)固定，聚焦后的胶片在12％(W/V)三氯乙酸中固定20min。 

进一步，染色方法为：经固定后的电泳胶片在考马斯亮蓝溶液中染色50min。 

进一步，脱色方法为：染色后的凝胶放在脱色液中脱色20min；脱色后的凝胶在室温下晾干过夜，用透明胶密封可长期保存。 

进一步，图象扫描方法为：脱色晾干后的胶片经扫描仪扫描，得出电泳图谱。