[发明专利]一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明为一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，属于生物疫苗领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（Infeetious Bursal Disease，IBD）是由传染性法氏囊病毒(Infeetious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种高度接触性传染病，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一，主要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊器官，该病的危害不仅直接造成鸡只死亡、增加淘汰率、影响增重，更重要的是破坏法氏囊中的B淋巴细胞，导致免疫抑制，使病鸡更易感其它疫病，对疫苗接种的免疫应答下降或丧失。

由于IBD在外界环境中较为稳定，采取消毒和隔离措施来控制本病不易达到目的。本病至今仍无有效的治疗方法，预防该病最行之有效的办法就是疫苗的接种。目前，市售的法氏囊疫苗绝大多数为鸡胚组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质量批间差较大、且容易产生鸡源性潜在疾病的感染等缺点。2011年初，哈药集团生物疫苗有限公司分离了一株法氏囊病毒（命名为：H11株），其具有在鸡胚成纤维细胞上增值的特性，基于此，本研究针对该毒种良好的细胞噬性，从接种材料、培养液改良、培养环境维护、冻干保护剂组分等方面，对现有的生产方法进行了改良，独创了新的传代细胞培养方法，按照本发明方法制备得到的活疫苗具有耐热性能好，病毒滴度高，稳定性好，适合进行大规模疫苗生产的特点，故而，申请人提出对优化过接种材料、培养液改良、培养环境维护、冻干保护剂组分等条件的新生产方法进行专利保护。

发明内容

本发明的目的为提供一种利用传代鸡胚成纤维细胞（CEF）制备传染性法氏囊病毒（IBDV）活疫苗的方法。按照本发明方法制备得到的活疫苗相较于鸡胚组织苗，病毒含量、产品合格率和免疫攻毒保护率都有显著的提高，疫苗的耐热性能显著，并且半成品阳性杂检率和单位体积的生产成本都有明显的降低。

本发明的一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）生产用毒种制备

①毒种繁殖

将毒种用灭菌生理盐水作10³～10⁴倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞；弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37℃吸附1小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液；37℃，5%CO₂条件下，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；于-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，-20℃保存；

②毒种鉴定

符合生产用种子标准；

③毒种保存

在-20℃以下保存，不超过9个月；

④毒种继代

不超过3代；

（2）传代细胞的制备

取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，传代培养，传代次数不超过5代；

（3）传染性法氏囊病毒病毒液的制备

①接种

弃掉细胞培养液，取生产用种毒，用灭菌生理盐水作10³～10⁴倍稀释，按培养液体积的1/10接种传代培养后的单层鸡胚成纤维细胞；37℃吸附1小时，加入培养液，并向其中添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37℃培养；

②培养

病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5mol/LNaHCO₃，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；

③病毒液收获

将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月；

（4）半成品检验

①无菌检验

每组病毒液分别取样，应无菌生长；

②病毒含量测定

每0.2ml病毒含量应为10^5.5EID₅₀，方可配苗；

（5）配苗及分装

①冻干保护剂的制备

A液：明胶5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去离子水定容至100ml，116℃，高压灭菌30min，15℃保存，不超过7天；