[发明专利]一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法及其N-末端氨基酸序列，本发明还涉及灰星鲨软骨血管生成抑制因子在制备抑制血管生成、防治肿瘤药物中的应用。 

  

背景技术

血管生成在人体发育和组织修复等正常生理过程中发挥重要作用，同时也是肿瘤、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎和慢性炎症等血管增生性疾病的重要病理特征之一。 

1970年，Folkman认为肿瘤的生长依赖于新生血管的生成，而通过抑制肿瘤的血管生成可达到治疗肿瘤的目的。目前，已有的研究证明当肿瘤的体积达到2~3 mm²以上时就必须依赖新生血管为其继续增殖提供必需的氧气和营养物质，而此时抑制肿瘤的血管生成，就会切断肿瘤的营养供给，导致肿瘤的退化、萎缩。因此，以抗血管生成为主的肿瘤生物治疗研究成为近十多年来抗肿瘤药物的研究热点。 

与常规抗肿瘤药物相比，肿瘤血管生成抑制剂具有许多优势：处于增生状态的血管有相对较高的靶分子表达，故肿瘤血管生成抑制剂治疗肿瘤具有良好的特异性。实体瘤生长和转移均须依赖血管生成，因而抗血管治疗具有广谱性。血管内皮细胞暴露于血流中，药物可直接发挥作用，故剂量小、疗效高、副作用相对较轻。内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。因此，抗血管生成的肿瘤治疗策略在未来的肿瘤治疗中将发挥重要的作用。 

申请人研究发现，以灰星鲨软骨为原料，制备血管生成抑制因子的研究处于空白阶段，而灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-I在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中的应用更是未见报道。 

  

发明内容

本发明的目的在于提供一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-I的N-末端氨基酸序列，具有这种N-末端氨基酸序列的灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-I显示强抑制血管生成活性。 

本发明的目的尚在于提供一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-I的方法。 

本发明的目的还在于提供一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-I的药理性质，以利用于制备药物。 

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-I，其特征在于该血管生成抑制因子的N末端15个氨基酸残基的排列顺序为DPGTGDYKGADEFAK SEQ ID NO:1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys SEQ ID NO:1，分子量为11.9 kDa，最适pH为7.0-8.5，稳定pH为5.0-9.0。 

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-I的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 

1）灰星鲨软骨蛋白粗提液的提取：将灰星鲨软骨破碎匀浆，按固液比1 g：5~10 mL加入到浓度为1.0 mol/L盐酸胍溶液中，于4 ℃以下振荡抽提24~36 h后，抽提溶液于4 ℃以下、5 000 r/min离心10~15 min，去除残渣，收集上清液；上清液继续在4 ℃下10 000 r/min离心15~20 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液于4℃以下透析18~24 h，每隔6 h更换Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液1次，透析袋内溶液即为灰星鲨软骨蛋白粗提液。

2）灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的制备：灰星鲨软骨蛋白粗提液置于4 ℃以下预冷0.5~1 h，缓慢加入4 ℃以下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置0.5~1 h后，于4 ℃以下10 000 r/min离心15~25 min，取离心上清液加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5~1 h后，4 ℃以下、9 000 r/min离心15~25 min，取沉淀置于截留分子量为8 kDa 的透析袋内用双蒸水于4 ℃以下透析18~24 h，每隔6 h更换双蒸水1次，透析液冷冻干燥，得灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分；