[发明专利]一种双增强子甲胎蛋白重组启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术，涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种双增强子甲胎蛋白重组启动子的构建，该重组启动子能够在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞内高效表达目的基因。本发明可用于在肝癌细胞内表达外源基因及制备靶向性肝癌基因治疗药物。

背景技术

近年来随着人们生活方式及环境的改变，多种恶性肿瘤的发病率均呈上升趋势，死亡率也居高不下，恶性肿瘤在许多城市已成为第一位死亡原因，在农村位列第二位。在常规的手术、放化疗等手段之外，亟需要开发新的治疗手段以提高治疗效果，降低死亡率。

肿瘤生物治疗是一种新的肿瘤治疗模式，其中基因治疗是开展较早研究的一种方式，我国批准了世界上第一个正式进入临床使用的基因药物表达野生型p53的腺病毒注射液“今又生”以及随后获得批准的溶瘤病毒药物重组人5型腺病毒（H101）注射液“安柯瑞”，国外也上市有用于化疗耐受的实体瘤治疗的携带Cyclin G靶向肿瘤及转移灶的逆转录病毒基因治疗药物Rexin G（该药目前在美国是治疗骨肉瘤、软组织肉瘤及胰腺癌的“孤儿药物（orphan drug）”。

靶向基因治疗是目前肿瘤基因治疗研究最重要一个方面。靶向基因治疗涉及多个环节，包括载体靶向性地进入肿瘤细胞、外源基因在肿瘤细胞中靶向性地表达，以及表达的外源基因靶向性地抑制、杀伤肿瘤细胞，其中外源基因在肿瘤细胞中靶向性地表达是一个研究热点。

正常细胞在各种致癌因素的作用下逐渐发生变化直至最后发生癌变，有很多在正常组织不表达或低水平表达的基因都表现出异常高表达的现象。这些基因之所以会在肿瘤细胞中有异常高的表达，是因为肿瘤细胞中该基因的启动子被活化以及细胞内具有丰富的与该启动子相关的转录因子、转录激活因子。因此这类基因的启动子常常被作为肿瘤特异性启动子（tumor-specific promoter）用于基因治疗中调控外源基因在肿瘤细胞中的靶向表达。

肝癌在我国是最常见的危害极大的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均相应地占全球半数。与其它常见恶性肿瘤相比，肝癌早期诊断较难，且恶性程度高，目前的手术和介入治疗等常规方式的疗效和预后均不理想，肝移植费用既高且又仍会复发，因此肝癌基因治疗研究有很重要的意义。

甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP）是肝癌的肿瘤标志物，在肝癌细胞中异常表达而在正常肝细胞中不表达，因此甲胎蛋白基因的启动是一个理想的肝癌特异性启动子，在很多肝癌靶向基因治疗中都被用作外源治疗基因的表达调控元件。例如带动自杀基因在肝癌细胞中的特异性表达[7]和设计肝癌特异性溶瘤病毒[8]等。和其它一些实验性肿瘤基因治疗研究常用的广谱的hTERT、Survivin等基因启动子相比，由于甲胎蛋白的表达不同于hTERT、Survivin等基因在肿瘤细胞和许多正常组织干细胞中也阳性表达，甲胎蛋白仅限于胚胎组织或成体肝癌（包括少量胃癌），因此基于甲胎蛋白启动子的基因治疗的特异性更好，对其它正常组织的副作用更小。

但是甲胎蛋白启动子也存在和包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）在内的其他一些组织特异性启动子一样的问题，即表达效率相对来说较低，而且由于不同的肝癌细胞中甲胎蛋白的表达水平有高有低，使得甲胎蛋白启动子在这些不同的肝癌细胞中的转录启动效率不一，从而影响其调控的目的基因的表达效率和所发挥的作用，最终导致基于甲胎蛋白启动子的靶向性肝癌基因治疗的效果不一，尤其是对一些甲胎蛋白表达水平较低的肝癌细胞的基因治疗效果较差。因此，从目前靶向性肝癌基因治疗的研究现状来看，要提高靶向性肝癌基因治疗的效果，必须提高特异性启动子甲胎蛋白的转录启动效率。

启动子是基因表达的基本调控元件，而增强子（enhancer）则可以显著提高启动子的启动效率的表达调控元件。人的甲胎蛋白基因启动子的5’侧翼有一个增强子区域，有多个肝细胞特异性转录因子结合位点，可以较大幅度地特异性地提高甲胎蛋白启动子的效率。

最近的一项基于巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）的早期转录增强子的功能研究表明，该增强子可以极大地提高很多基因启动子的转录启动效率。

为了提高甲胎蛋白基因启动子的转录启动效率，目前在利用甲胎蛋白基因启动子进行的研究工作中，有采用一些增强子来提高其启动效率的报道，但采用的都是单一的增强子。

发明内容