[发明专利]一种博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒中包含有筛选获得的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，通过一步法实时荧光PCR可检测出的HBoV的最低浓度为1.0×10²copies/mL，这说明本试剂盒的灵敏度和特异性非常高。

背景技术

博卡病毒(Bocavirus，BoV)是一个直径25nm的球形核衣壳为20面体对称的六角形病毒颗粒，为一单链线状DNA病毒。博卡病毒是由瑞典科学家Allander等于2005年运用分子病毒筛查方法，从呼吸道感染患儿鼻咽分泌物中进行病原检测，分离得到的一种新型的人类细小病毒，命名为人类博卡病毒(HBoV)。它属于细小病毒科，博卡病毒属。根据目前研究，BoV基因组由3个开放阅读框构成。2个主要开放阅读框分别编码非结构蛋白(NS1)和至少2个衣壳蛋白(VP1和VP2)，一个次要开放阅读框编码功能未知的非结构蛋白NP1。VP2蛋白是主要的衣壳蛋白，其片段虽较VP1蛋白短，但占全部衣壳蛋白的95％以上。HBoV的非结构蛋白NS1较为保守，而VP1和VP2较易发生突变。

HBoV是人类呼吸道感染常见而重要的病原体之一。在相关呼吸道疾病中，成年人多表现为上呼吸道感染，而小儿表现主要有肺炎、鼻炎、喉炎、支气管炎、毛细支气管炎、支气管哮喘等。HBoV感染多见于小于5岁的婴幼儿，高峰年龄在6月～2岁的婴幼儿。HBoV所致的呼吸道感染全年均可发生，Sloots等发现整个冬季均能检测到HBoV，而在初冬其感染较为盛行。目前HBoV病毒的传播途径仍未明确。HBoV多在呼吸道分泌物标本中被检出，因此与其他呼吸道病原体一样，打喷嚏、咳嗽和物理传播等通过空气传播的可能性很高。而在血清标本、粪便标本及尿液样本中均能检测到HBoV，故亦不能排除粪-口传播及血液传播的可能性。

发明内容

本试剂盒检测的基本原理是利用一对特异性的寡核苷酸引物和一条特异性寡聚核苷酸探针，在耐热DNA聚合酶、高品质的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）以及Mg²⁺等PCR反应缓冲液，通过荧光PCR扩增仪实现靶核苷酸的扩增，从而实现分别快速、高效、特异、实时定量检测博卡病毒寡核苷酸的目的。

为了高效、特异、灵敏的检测出博卡病毒，本发明在对GeneBank中所有的现有的博卡病毒基因序列进行生物信息学分析，找出了博卡病毒的特异性保守区，并对这个保守区域设计了多对引物、探针。通过对博卡病毒标准株的检测，筛选出灵敏度高、特异性好、且针对博卡病毒的一对引物（用于扩增博卡病毒靶多核苷酸）和一条探针，即：能与双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物HBoV-F、能与双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物HBoV-R、能与靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HBoV-P，其中荧光报告基团任选自FAM、TET、JOE、HEX、VIC；荧光猝灭基团任选自：TAMRA、DABCYL、BHQ。

其中：所述正向引物HBoV-F的序列为：CGYTGGATGCGNTTYCATGA（SEQ ID NO：1）；所述反向引物HBoV-R的序列为：CTTAGACGCCATCATCATTYAC（SEQ ID NO：2）；所述寡核苷酸探针HBoV-P的序列为：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA（SEQ ID NO：3），优选的，该寡核苷酸探针5’端连接有FAM(5’羧基荧光素)，3’端连接有TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明)；上述序列中，其中N代表A、T、G或C，R代表A或G，Y代表C或T。

所以本发明提供了一种用于检测博卡病毒的寡核苷酸组合物，所述组合物包含1)-4)中任一个：

1)寡核苷酸正向引物HBoV-F；2)寡核苷酸反向引物HBoV-R；3)寡核苷酸探针HBoV-P；4)1)-3)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。本发明还提供了上述寡核苷酸组合物在制备检测博卡病毒的试剂中的应用，其中所述试剂为用于实时荧光PCR的试剂。