[发明专利]一种新型狂犬病病毒假病毒系统及其制备与应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型狂犬病病毒假病毒系统及其制备与应用。

背景技术：

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RV)引起的一种人兽共患传染病，一旦发病，病死率几乎100％。发生狂犬病暴露时需要及时进行狂犬病暴露后处置，主要包括接种狂犬病疫苗和注射狂犬病免疫球蛋白制剂，使机体产生或获得狂犬病病毒中和抗体，从而阻止病毒入侵机体。

国内人用狂犬病疫苗生产企业普遍应用的狂犬病病毒疫苗株为PV、CTN1、aG，然而国内对这些疫苗株抗原性和保护性的研究资料并不充分，原因在于狂犬病病毒野毒株的分离、培养需要在BSL-3级实验室进行，并且国内分离的狂犬病病毒野毒株数量有限，限制了疫苗接种后野毒攻击试验的开展范围。依据疫苗株和野毒株核酸和氨基酸序列相似性来推导抗原性相似是目前较通用的做法，然而，大量抗狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白单克隆抗体结合试验提示狂犬病病毒野毒株和疫苗株在抗原性方面存在差异，仅依靠序列相似性来推导抗原相似性的做法并不妥当。建立一种行之有效的模型在体外试验水平评估人用狂犬病病毒疫苗株免疫对野毒株的保护效果有一定意义。

快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)是世界卫生组织(World Health Organisation，WHO)推荐的狂犬病病毒中和抗体体外检测方法之一，该方法是在细胞培养基础上进行的微量中和试验，一个流程可在24h内完成，在96孔板上进行适合大批量样品检测，通常用于评价疫苗接种后机体对狂犬病病毒的中和能力。考虑到攻击病毒为野毒株时需要BSL-3级实验室并且野毒株数量有限，如果可以采用狂犬病病毒野毒株的模拟病毒(即狂犬病病毒假病毒)作为攻击病毒，那么一方面可以扩大验证范围，另一方面有可能降低实验所要求生物安全级别。

发明内容：

假病毒包装系统主要有：以鼠类白血病病毒(murine leukemia virus，MLV)为基础构建的逆转录病毒载体和包装组份；以慢病毒(lentivirus)，如HIV-1，为基础构建的慢病毒载体和包装组份。以慢病毒载体为基础的假病毒不同于以逆转录病毒载体为基础的假病毒，对分裂期和非分裂期细胞均具有感染能力。利用假病毒模拟病毒包膜糖蛋白活性使一些没有敏感培养细胞系的病毒(如HCV)的中和抗体检测成为可能，也使一些生物安全级别要求较高的病毒(如HIV)的中和抗体检测可以在BSL-2级实验室进行。关于制备狂犬病病毒假病毒进行狂犬病相关研究的报道非常有限和缺乏系统性。

为了克服目前狂犬病病毒研究的上述局限性，本发明利用逆转录病毒和慢病毒载体平台构建狂犬病病毒假病毒，并在此基础上摸索将狂犬病病毒假病毒应用于狂犬病病毒中和抗体评价、狂犬病病毒中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗狂犬病病毒药物(进入或融合抑制剂)高通量筛选、新型狂犬病疫苗制备，形成一套全新的狂犬病病毒假病毒构建、制备及应用技术体系。

本发明的技术方案如下：

一种新型狂犬病病毒假病毒系统，包括含有狂犬病病毒糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭质粒与辅助质粒所共同构成的载体系统以及宿主细胞，将载体系统中的穿梭质粒和辅助质粒共同转染宿主细胞后，即可在培养上清中获得狂犬病病毒假病毒。

如上述技术方案所述狂犬病病毒假病毒系统，其中，所采用的pVRC-RVG系列穿梭质粒为分别含有狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11、疫苗株PV、CTN1、aG的糖蛋白基因序列并能表达相应蛋白的质粒pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTN1G、pVRC-aGG。

如上述技术方案所述狂犬病病毒假病毒系统，其中，优选采用慢病毒双质粒系统，慢病毒三质粒系统、逆转录病毒三质粒系统亦可采用。

如上述技术方案所述狂犬病病毒假病毒系统，其中，其所述辅助质粒分别为慢病毒双质粒系统的pNL4-3.GFP/Luc.R-E-，慢病毒三质粒系统的pCS-CG+pCMVΔR8.2以及逆转录病毒三质粒系统的pMLV-gagpol+pMLV-EGFP。

如上述技术方案所述狂犬病病毒假病毒系统，其中，所优选采用的宿主细胞为293FT细胞。

新型狂犬病病毒假病毒的制备方法，包括如下步骤：

a、采用pVRC载体构建含有狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11、疫苗株PV、CTN1、aG糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭质粒pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTN1G、pVRC-aGG；