[发明专利]一对番茄潜叶蛾特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明一对番茄潜叶蛾特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

番茄潜叶蛾Tuta absoluta(Meyrick)，属鳞翅目、麦蛾科，是番茄的一种世界性毁灭性检疫害虫，2004年被列为欧洲和地中海植物保护组织(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)的A1类检疫性有害生物之一。番茄潜叶蛾为寡食性害虫，对番茄的危害尤为严重，且大田和温室均可发生；此外，亦可为害茄子、马铃薯、青椒、人参果、烟草等经济作物，龙葵、银叶葵、拟刺茄、皂味茄等非栽培茄科植物，以及多刺曼陀罗、曼陀罗、光烟草等天然茄科植物；亦有报道显示，番茄潜叶蛾还可以为害茄科的灯笼果和豆科的豇豆，以及茄科枸杞属和锦葵科锦葵属的植物等。番茄潜叶蛾可在寄主植物的整个生长期进行为害，主要以幼虫潜入寄主植物的果实、叶片以及嫩茎等组织中取食为害，以顶芽、花、幼果受害后损失最为惨重，露地及保护地番茄均可严重受害。花和幼果受害时，或造成落花落果，或招致病害原微生物寄生而腐烂，直接减产明显；为害叶片时，幼虫仅取食叶肉组织而留下上下表皮，并形成不规则的潜道，严重影响植物光合作用，最终导致叶片枯死；蛀食嫩茎形成的隧道，常使受害植株生长畸形，且易于倒折；而顶芽受害时，植株完全停止生长。为害马铃薯时，只取食其地上部分，不为害地下部块茎，但会使产量明显降低。通常，番茄潜叶蛾可在寄主植物的任何时期进行为害，但以叶片受害最为严重，其次为叶脉和茎，花萼及绿色的果子亦可受害，严重受害时植株呈火烧状。如若不及时控制，可使番茄减产达90-100%，番茄产业（包括鲜食和深加工）遭受的经济损失达50-100%，因此被国际马铃薯研究中心认定为是为害马铃薯叶片的最为重要的害虫之一。

番茄潜叶蛾原产于南美洲，自二十世纪60年代以来一直是该洲番茄作物上的一种重要害虫，其发生区域主要有阿根廷、玻利维亚、巴西、智利、哥伦比亚、厄瓜多尔、巴拉圭、秘鲁、乌拉圭、委内瑞拉等10个国家。然而，自2006年底在西班牙东部首次发现番茄潜叶蛾为害温室番茄以来，很快便在摩洛哥、突尼斯以及芬兰、意大利、荷兰、阿尔巴尼亚、阿尔及利亚、葡萄牙、保加利亚、塞浦路斯、德国、以色列、匈牙利、立陶宛、塞尔维亚、英国、俄罗斯、瑞士等近20个国家严重发生，近期又在希腊发现它的踪迹，在地中海盆地呈迅速扩张之势，使欧洲番茄生产遭受了严重打击，堪称世界番茄和马铃薯产业的一种毁灭性害虫。此外有研究显示，1962年日本曾有疑似番茄潜叶蛾为害野茄子的报道，之后未曾提及，故其在日本的发生尚有待商榷。目前，我国尚未有番茄潜叶蛾的发生，因此加强对番茄潜叶蛾的检疫检验，是保障我国番茄和马铃薯、烟草等产业健康发展的首要前提。

番茄潜叶蛾为小型蛾类昆虫，成虫体长6-7mm；卵长0.36mm，宽0.22mm，圆柱形，奶白色至桔黄色，肉眼难以发现。雌性成虫主要将卵产于叶片背面，亦可产在叶片正面、芽、茎或绿色的果子上，幼虫一经孵化即潜入叶片、茎秆或果实内进行取食为害；老熟幼虫可在土中化蛹，亦可在叶片表面或潜道内化蛹。而加强检疫和监测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于番茄潜叶蛾鉴定的方法主要有：1）形态特征鉴定；2）PCR技术等。但目前国内针对番茄潜叶蛾尚没有标准的检测方法。

RAPD和ITS、COI技术曾用于区分番茄潜叶蛾的不同地理种群。RAPD技术检测是以基因组DNA为模板，以单条人工合成的随机多态核苷酸序列为引物，在DNA聚合酶的催化下，进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上根据多态性来判断检测结果。rDNA ITS技术和mtDNA COI技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。SS-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性好和稳定性强等优点。

发明内容

本发明的目的为提供一对番茄潜叶蛾特异性SS-COI引物。

本发明的另一目的为提供一种番茄潜叶蛾的特异性快速PCR检测方法。

本发明的再一目的为提供一种番茄潜叶蛾的特异性快速PCR检测试剂盒。