[发明专利]一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，主要用于已获得的植物根际促生细菌的驯化，通过驯化获得具有植物防病促生能力的多功能有机磷农药降解细菌。

背景技术：

农药在农业生产中发挥了巨大的作用，据联合国粮农组织统计，如果不使用农药，全世界每年因病虫草害造成的损失约占农作物总产量的36％，年损失高达1250亿美元(Cooper and Dobson，2007；Eddleston and Bateman，2007)。农药的使用保证了农业的稳产丰收和人类的食物供应。有机磷农药(Organophosphorus pesticide，OPs)是当今农药的主要类别，具有经济、高效、方便等特点，是国内外广泛生产和使用的农药产品。

但农药的大量使用对生态环境造成了很大的破坏性。农药利用率仅为10％～20％，其余80％～90％最终将进入土壤环境，致使土壤中的农药残留严重，残留的农药随着食物链上升，最终危害人类健康(Carvalho，2006；Costa et al.，2008)。在世界上许多国家和地区，尤其是发展中国家，由于有机磷农药的持续大量使用已经对区域生态系统造成了严重的污染，在肉、奶制品、谷物、蔬菜和水果等产品中都不同程度检测到能够抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经传导功能紊乱，诱发免疫系统疾病，致使人中毒死亡的有机磷农药的残留。据统计，每年全世界发生300万例有机磷农药中毒事件，造成20万人死亡。为此，自20世纪80年代末以来，世界上许多研究机构都致力于探索有机磷农药污染环境的生物修复技术，并于1991年3月在美国圣地亚哥召开了第一届“原位与就地生物修复”国际会议，这一会议的召开，标志着以生物修复为核心的环境生物技术进入了一个全新的发展时期。

环境修复技术中，生物修复技术被公认为是效果好、见效快、简便易行、安全、廉价和环境友好、无二次污染的方法，已成为环境科学的研究热点，具有广阔的应用前景。常说的土壤生物修复技术主要就是指微生物修复。利用微生物修复土壤农药污染的主要原理是微生物利用有机农药作为碳源、氮源与磷源，将复杂有毒的农药化合物分解成简单无毒的化合物，或者彻底分解为CO₂、H₂O、NH₃和Cl^-，从而降低农药在土壤中的残留量及毒性(Mansour and Gad，2010；康纪婷，2010)。

获得降解有机磷农药的微生物的途径有很多，最常用的是从受到有机磷农药严重污染的土壤中分离筛选出能降解有机磷农药的菌种。定向培育法是近年来常用的一种方法，即在特定的土壤中人为的多次施用农药，驯化出能降解这种农药的微生物，再通过富集培养，从中分离筛选能高效降解这种农药的菌株(赵宇蕾，2009；康纪婷，2010)。这种单一功能菌的纯化筛选，只根据所需的功能要求从自然界中分离、纯化，得到目的单一的菌株。这种筛选方法有其不足之处，一是在土壤中人为施用农药，使得其他菌株不能生存，导致目标菌株失去了与自然条件下长期处于协同关系的其它菌共存的机会，虽然目标菌株的目标功能有所强化，但功能单一；二是单一菌的纯化使其对生长条件的适应范围越来越狭窄，对发酵条件要求高，发酵成本昂贵；三是单一功能菌孤立生长，容易受到其它菌的污染和抑制，重新施入土壤后，难以生长繁殖和发挥功能。

已分离的有机磷农药污染土壤生物修复的微生物中，以细菌和真菌为主(Fox and Mendz，2006；郭子武，2008；Al-Qurainy and Abdel-Megeed，2009；Forlani et al.，2011)，细菌主要包括：假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单胞杆菌属(Xanthamonus)、固瘤细菌属(Azotomonus)、硫杆菌属(Thiobacillus)等，其中假单胞菌属的菌株最活跃，对多种有机磷农药具有降解作用。真菌主要包括：曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Pinicielium)、木霉属(Trichoderma)、酵母菌(Saccharomyces)等。细菌由于其生理生化的多种适应能力以及容易诱发突变菌株，在降解有机磷农药的微生物中占有重要地位，因此对细菌的研究比较全面和深入。