[发明专利]非小细胞肺癌中miR-34a基因的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种非小细胞肺癌中miRNA基因的应用。

背景技术

微RNA（microRNA, miRNA）功能调控是当前生命科学的重要前沿。miRNA是一类长度为21-22 nt 的非编码RNA分子，其通过转录后基因沉默调控靶基因的活性。对miRNA生物学功能及其调控的靶基因的研究表明，miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗的新途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列（3′-UTR或 5′-UTR）存在着一对多的关系。miRNA通常是在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录，初级转录产物为pri-miRNA，pri-miRNA被核酸酶RNase Ⅲ Drosha和其辅助因子Pasha加工成为发卡型前体miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA被转运蛋白Exportin 5从细胞核输出到细胞质，之后被Dicer酶复合物剪切成为短的miRNA双链，在解旋酶的帮助下miRNA双链被解离，成熟的miRNA和RNA诱导的沉默复合体结合（RISC）。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 3′- UTR中的互补序列相结合，随即依据miRNA与其靶基因序列的互补性高低，或是抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。 

肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，并且每年新增病例120万。肺腺癌（lung adenocarcinoma）是最常见的癌症，其中约80%的肺癌是非小细胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC），其5年存活率仅为15%，主要原因是缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段。miRNA通过调控靶基因mRNA的翻译，在肺癌发生、发展及转移发挥重要作用。miRNA可能成为新的肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物，有助于疾病的准确诊断及个性化治疗。这一切设想的实现必须建立在miRNA靶基因功能研究工作的基础上。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种非小细胞肺癌中miR-34a基因（5′-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3′）抑制癌细胞增殖中的应用。

            本发明的目的之二在于提供一种miR-34a基因在促进癌细胞凋亡中的应用。

            本发明的目的之三在于提供一种miR-34a基因在H1299细胞系中下调TGFβR2表达水平的应用。

本发明首先利用Solexa测序技术，利用qRT-PCR技术检测多种非小细胞肺癌系中miR-34a的表达量变化，并从中选择一种miR-34a表达下调最明显的非小细胞肺癌系，在此细胞系中过表达miR-34a以检测其功能。

细胞转染所用的转染试剂为Lipo2000（Invitrogen）。为了降低细胞密度、试剂用量及转染等因素造成的孔间差异，保证实验的可靠性和重复性，本实验中每个转染样品设置了3个复孔。接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。

细胞总RNA的提取采用生工生物公司的Trizol试剂。具体提取步骤如下：     

直接在培养板中加入Total RNA Extractor裂解细胞，每10 cm²面积加1 ml Total RNA Extractor，用移液器吹打混匀；

将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10 min，使得核蛋白与核酸完全分离；

加入0.2 ml 氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。12,000 rpm 4 ℃离心10 min；

吸取水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min；

12,000 rpm 4 ℃ 离心10 min，弃上清；

加入1 ml 75%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm 4 ℃ 离心3 min，弃上清，室温干燥5-10 min；

加入30-50 ??l RNase-free ddH₂O，充分溶解RNA，将所得到的RNA溶液置于-70 ℃保存或用于后续试验。