[发明专利]一种杂草稻检测用引物及其应用

说明书

技术领域

    本发明涉及一种杂草稻快速检测用引物。 

背景技术

    杂草稻(weedy rice)往往与栽培稻相伴生，分布极为广泛，几乎存在于世界上所有的稻作生产区。在世界上温带地区一些种植水稻国家危害已成为仅次于稗草和千金子的第三大杂草，密度达到2-40株/m²时可使水稻减产19%-89%，全季度干扰可使水稻减产61%，且蔓延速度不断加快，危害程度不断升级。 

杂草稻之所以会对水稻的生产造成较大的危害，主要是由于：1）其与栽培稻的相似性，使它和栽培水稻对对除草剂的反应一致，世界上尚无有效的除草剂；2）杂草特性强，主要表现为种子落粒性、休眠性及抗逆性，从而使杂草稻能够忍受恶劣的环境条件，种子逃脱收获，进入土壤种子库，并度过恶劣条件时期，在适宜条件下萌发再生，从而使杂草稻在田间人工种植的环境下不断繁衍，特别是由于水稻轻型栽培技术的推广应用以及直播面积的扩大，更适合其发生，种群迅速扩大；3）竞争能力强，在水稻整个生长期间，杂草稻与栽培稻竞争光和矿质营养等；4）种子污染，杂草稻颖壳色多样，种皮色多样，种子混在收获的水稻种子中，导致栽培稻种子商业品质的降低。 

此外，我国转不同外源基因的水稻正陆续培育出来，它们的即将释放正吸引世人的关注。其中转基因水稻的抗性基因向杂草稻逃逸的风险评价较早就受到关注，这是因为：1）空间上，杂草稻和转基因水稻伴生；2) 时间上，杂草稻将与转基因水稻花期相遇，通过将全国采集来的杂草稻进行田间种植，发现我国各地杂草稻开花期与各地栽培水稻重叠相间；3）杂草稻与转基因水稻在生物学上有相当高的杂交亲和性，且杂种后代能正常繁殖。 

当前，由于杂草稻与栽培稻的相似性，使它和栽培水稻对对除草剂的反应一致，世界上尚无有效的除草剂。世界其他国家的防除经验表明，保证栽培稻用种不被杂草稻污染，是防止杂草稻快速蔓延扩散的重要措施。因此，快速准确鉴别我国杂草稻，将极大促进我国杂草稻的防除工作。 

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能够快速检测杂草稻的引物及应用该引物的分子检测试剂盒与检测方法。 

为了达到上述目的，本发明提供了一种杂草稻检测用引物WR4，包括正向引物5’-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’和反向引物5’-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’。 

本发明还提供了一种杂草稻快速分子检测试剂盒，该试剂盒采用引物WR4，包括正向引物5’-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’，反向引物5’-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’。 

本发明还提供了一种杂草稻快速检测方法，该检测方法用于检测区分杂草稻与栽培稻；包括以下步骤： 

（1）DNA提取：提取待检测的杂草稻或栽培稻DNA；

（2）PCR扩增：将步骤（1）提取的DNA进行PCR扩增；PCR扩增采用WR4引物，包括正向引物（WR4-F）5’-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’，反向引物（WR4-R）5’-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’；

（3）电泳：将步骤（2）中的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，染色观察。

其中，步骤（1）中DNA提取过程如下：取待检测的杂草稻或栽培稻的颖果去壳，加65℃预热的提取液（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 20 mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl，1.5% SDS）研磨后，再加入65℃预热的提取液冲洗，转入离心管中，加入65℃预热的提取液，65℃水浴30分钟；加入NaAC，摇匀；加入氯仿-异丙醇-乙醇混合液，摇匀，离心后，移取上清液；向上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇，摇匀，离心后，取沉淀，70%乙醇漂洗后，置于吸水纸上得干燥DNA；所述氯仿-异丙醇-乙醇混合液中异丙醇的体积百分含量为4%，乙醇的体积百分含量为10-20%。