[发明专利]岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种代谢产物的测定方法，特别是岩白菜素在生物体内代谢产物的测定方法。

背景技术

岩白菜素(bergenin)，分子式是C₁₄H₁₆O₉，分子量为328.27，结构式如下：

又称岩白菜内脂、矮茶素、虎耳草素、岩白菜宁、佛手配质、鬼灯檠素、Bergenit，Vakrint，AmlisieacidB．，Cuscutin，Pehaphorin,白色疏松针状结晶或结晶性粉末，遇光和热变色，在甲醇中溶解，在水或乙醇中溶解较少。《中国药典》收为镇咳祛痰药，用于慢性支气管炎的治疗。目前岩白菜素的制剂有单方和复方制剂，单方为普通片，复方制剂中添加了马来酸氯苯那敏，含量为岩白菜素125mg、马来酸氯苯那敏2mg/片，复方的主要剂型有普通片、滴丸、口含片、软胶囊、糖浆、颗粒剂、口服液等，其中以复方普通片应用最广,以岩白菜素为原料的多种复方制剂已用于临床。

岩白菜的化学成份及其药动/药效学一直是国内外岩白菜研究的热点之一,关于其活性成分岩白菜素原形的测定方法有很多,有纸上层析法、紫外吸收法、薄层扫描法,高效液相色谱法、反相高效液相色谱法等。但是多局限于针对天然植物或药片中的原形药物的含量测定；限于检测技术及其体内浓度过低，对其体内药代动力学研究国内外一直是难点，近年来有极少数文献报道了给药后原形药物的体内测定方法；而给药后测定其体内代谢产物的灵敏准确方法至今国内外未见报道，药物体内代谢研究的不完善使人们对岩白菜素类药物的认识和掌握仍未全面。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法，灵敏度高，特异性强，方便可行。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法，包括步骤如下：

（1）将给药后的待测血浆、尿液、胆汁样及未给药的空白血浆、尿液、胆汁样分别按体积比0.3:2加入乙腈，涡旋混合1-3min，10800rpm速度离心2-5min，取上清液，40°C水浴中用氮气吹干后，加入原样体积1/3的乙腈复溶；

将给药后待测粪便及未给药的空白粪便按比例500:4，mg/mL第一次加入乙腈，涡旋3-5min后将混悬液超声1h，5000rpm速度离心8-10min，分离获得上清液I，剩余下层另加入乙腈，重复上述步骤获得上清液II，混合上清液I和II，40°C水浴中用氮气吹干后，加入第一次用量5%的乙腈复溶；

（2）将上述制备的各待测液（包括空白样本及给药样本）分别取10μL进样，HPLC/Q-TOF MS/MS进行分析，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18 column(2.1×100mm,3.5μm)，柱温25°C，流动相A为水，流动相B为乙腈，先后以流动相比例为5%–95%B流动0–20min，95%B流动20–22min，95%-5%B流动22-25min，流速：0.8ml/min；离子源为ESI源，负离子模式，喷雾气（N₂）压力350Pa，干燥气（N₂）流速10.0L·min^-1，干燥气温度为350℃，毛细管电压3500V，碎片电压选择120V；质量数扫描范围m/z100～1000；上述条件下得到各待测液（包括空白样本和给药样本）总离子流色谱图；

（3）用Aglient Metabolite ID软件对空白样本和给药样本总离子流色谱图对比，然后对空白样本和给药样本总离子流色谱图提取离子与二级碎片进行对比鉴定，得到岩白菜素M0(m/z,327.07)，三种代谢产物M1(m/z,503.11),M2(m/z,407.03)和M3(m/z,359.09)；

（4）对比分析M1、M2、M3与岩白菜素的二级碎片得出岩白菜素在动物体内代谢产物为葡糖醛酸结合产物，硫酸结合产物，水解和甲基结合产物。

所述的动物体指哺乳动物。

本发明首次建立一种灵敏度高，特异性强，方便可行的HPLC/Q-TOF MS/MS（高效液相色谱/四极杆-飞行时间/串联质谱）法并成功测定到动物体内岩白菜素的代谢产物，并在此基础上分析出其可能代谢途径，对进一步的体内药物代谢动力学研究和临床指导合理用药具有重要意义，也为进一步开发利用岩白菜素类药物提供了可靠基础。

附图说明

图1为空白与给药胆汁样本岩白菜素及各代谢产物的提取离子色谱图；